植物端粒酶活性的检测方法技术

本发明专利技术公开了一种植物端粒酶活性的检测方法，依次包括以下步骤：1)植物端粒酶初提取液制备；2)植物端粒酶的富集：每10ml初提液中加入0.9～11克经DEPC处理的PEG6000；3)蛋白含量的测定：取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)端粒酶的酶促反应及产物的回收：将灭活预处理后富集上清液作为对照组；将富集上清液作为实验组；经处理后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；5)DNA含量测定：将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解；然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物端粒酶的鉴定技术，特别是一种植物端粒酶分离和检测的方法。
技术介绍
端粒是真核生物染色体末端的一种特殊结构，近年来，大量研究表明染色体端粒与细胞遗传稳定，与细胞分裂力、细胞生活力、生命力密切相关。它的长度随细胞的分裂次数而缩减，但它也能在端粒酶催化下合成和延伸，保持一定的长度。研究发现90%以上的人类癌变细胞具有端粒酶活性，突显出端粒酶对细胞癌变过程中的重要作用(正常人类细胞中端粒酶活性很低，一旦细胞癌变就会出现端粒酶活性提高的现象，目前已用于细胞癌变的一个重要生理指标之一)。尤其是植物生物体细胞的可持续性分裂，端粒酶是不可缺少的，且至关重要(少了端粒酶的作用，植物细胞很难维系不断的繁殖、生长过程)。由于在植物组织中端粒酶的活性远低于动物组织，即使在活性较高的植物分生组织或愈伤组织中通常都难以检测。因此，时至今日还没有一种技术方法能有效、快速地分离和检测植物端粒酶活性的方法。目前的现有的来源于动物端粒酶的检测为“TRAP方法”，是直接将提取液进行酶促反应，然后检测反应物的量。由于动物组织中，端粒酶活性较高，直接的提取液容易检测。但对于端粒酶活性较低的植物组织，这样直接检测就存在很大问题，主要是检测灵敏度不够 (酶含量很低)，甚至对一些低活性的组织就无法检测端粒酶活性。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种工艺简洁、结论准确的。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种，包括以下步骤1)、植物端粒酶初提取液制备利用液氮将待测植物组织充分研磨后，于3 5°C加入提取液后继续研磨成勻浆； 然后，3 5°C，15000 17000g离心12 17min，所得的上清液作为初提液；所述提取液为50mMpH 7. 5Tris_HCl，5. OmM MgC12, IOOmM KCl,20mM EGTA, 1. OmM DT Τ，0· ImM PMS F, 1. 5% PVP, 10%甘油；即，每 IOOml 的所述提取液中，含有 50mM pH 7. 5Tris_HCl、5. OmM MgCl2UOOmM KCl、20mM EGTAU. OmM DTT、0. ImM PMSF、1.5g PVP 禾Π IOml 甘油，其余为水；植物组织与提取液的用量比为2. 5g待测植物组织/8 12ml提取液；2)、植物端粒酶的富集每IOml初提液中加入0. 9 11克经DEPC处理的PEG6000，于3 5°C下上下颠倒至PEG6000充分悬浮后继续震荡(轻微震荡)30min ；然后于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，去除上清后，加入3 4ml提取液，3 5°C悬浮搅拌，再于3 5°C、15000 17000g离心12 17min，得富集上清液；该富集上清液中含有植物端粒酶，至此步骤已完成植物端粒酶的分离；3)、蛋白含量的测定取步骤2)所得富集上清液测定蛋白含量；4)、端粒酶的酶促反应及产物的回收取步骤2)所得的富集上清液的一部分，经65°C 15min灭活预处理，得灭活预处理后富集上清液作为对照组；步骤2)所得的富集上清液的另一部分，作为实验组；将对照组和实验组分别进行以下处理取含有IOOmg蛋白的灭活预处理后富集上清液/含有IOOmg蛋白的富集上清液放入离心管中，加入30 μ 1 IOX酶促反应液，用ddH20 定容至300 μ 1，18 20°C保温12 14min ；然后92 96°C酶灭活处理0. 8 1. 2min ；再加入280 320 μ 1的氯仿，充分混勻，于3 5°C，20000 22000g离心12 17min，取上清，加入1/10氯仿体积量的3M醋酸钠溶液以及加入异丙醇，混勻，再置于-18 -22°C冷冻50 70min，所述异丙醇的体积是氯仿和3M醋酸钠溶液体积量之和的0. 8 1. 2倍；再 3 5°C、20000 22000g离心18 22min，去除上清后，用体积浓度为70 80%的乙醇洗涤沉淀；待沉淀自然干燥后，分别得对照组回收产物/实验组回收产物；备注说明上述灭活预处理不会使蛋白的含量发生变化；5)、DNA 含量测定将步骤4)所得的对照组回收产物/实验组回收产物分别加入无菌水充分溶解 ’然后分别测定ssDNA的量；将实验组回收产物的ssDNA含量减去对照组回收产物的ssDNA含量，得植物端粒酶活性。注植物组织的端粒酶活性定义为每IOOmg蛋白中所含端粒酶，在19°C，13min 能合成ssDNA的量。作为本专利技术的的改进步骤3)通过普通分光光度计测定富集上清液中蛋白含量。作为本专利技术的的进一步改进步骤4)中的 IOX 酶促反应液为0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KCl, IOOmM EGTA、0. 1% Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0· 1% BSA、2. OmM 的前导引物；前导弓丨物为5，-ATGATGTGCAACTCGACAACTT-3，。即，每 IOOml 的 IOX 酶促反应液中含有0. 5M pH 8. 3Tris_HCl、50mM MgCl2、0. 5M KClUOOmM EGTA、0. Iml 的 Triton χ-lOOUOmM DTT、0. 5mM dNTP_C、0· 1 克的 BSA 和 2. OmM 的前导引物，其余为水。备注说明dNTP_C即在dNTP中除去dCTP而得。作为本专利技术的的进一步改进步骤4)中酶促反应中前导引物寡核苷酸的3’端的4个碱基不可改变(即特定3’端的ACTT不可改变)，其余碱基容许有一定变化。在本专利技术的步骤4)中，用于洗涤沉淀的乙醇(体积浓度为70 80% )的体积量一般为氯仿体积量的0. 8 1. 5倍。本专利技术具体是通过以下技术方案来实现的41、对所有用具、器皿进行常规的去RNase的处理。由于植物端粒酶的活性，除了它的蛋白质亚基外，关键是保持它的RNA模板序列的完整性。建议在整过分离过程中，按常规提取总RNA要求的条件进行。2、植物端粒酶初提取液的制备。利用液氮将待测植物组织充分研磨后，加入提取液，继续研磨成勻浆。然后，离心分离后，保留上清液。3、采用聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)从提取样品液中富集端粒酶蛋白。 不同分子量的PEG可选择性吸附分子量以及三维结构不同的蛋白。因此，选择最合适分子量的PEG对植物端粒酶蛋白的富集是至关重要的。因此，在本专利技术中选用了 PEG6000。4、植物端粒酶蛋白的洗脱。从富集植物端粒酶蛋白的PEG样品中，利用PEG/提取液的比例不同能进一步有选择性的将植物端粒酶蛋白从PEG中洗脱。因此，这也是对植物端粒酶蛋白的富集关键步骤。5、植物端粒酶样品总蛋白的定量测定。通过普通分光光度计测定样品中蛋白质含量，以确定酶促反应中加入样品提取液的体积。6、植物端粒酶酶促反应。根据Kim，1996年发现的端粒酶反应原理，端粒酶对特定条件的DNA寡聚核苷酸的前导引物作用，并能有效延伸其前导引物。由于任何酶促反应均涉及到反应温度，反应时间等反应条件。因此，获得最佳的反应条件是重要的。7、反应产物的回收与定量测定。反应产物仍为单链DNA，且片段较短，建议采用沉淀回收方本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘小川，刘红彦，马登旭，
申请(专利权)人：浙江理工大学，
类型：发明
国别省市：