高功能抗体生物合成，本发明专利技术提供了一种筛选重组抗体的新方法。该方法运用一反复循环过程：“基因库多样化→蛋白表达→功能筛选”，直至获得满意的抗体为止。在进行抗体表达时，一多用途的多肽序列(Tag)连接在抗体的C端。该多肽序列可将单链抗体(scFv)形成二聚体(scFv)2，进一步加强抗体的亲和力。该多肽序列也可作抗体的标记、纯化及检测之用。采用该方法，我们成功地获得了一些抗CEA的单链抗体。其中一抗体可直接发展为诊断、治疗试剂。这些抗体将提供有用的CDRs库，通过序列重组产生所需的高活性CEA抗体。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种制备抗体或其他蛋白质分子的方法。
技术介绍
近几年的研究表明抗体可用作诊断和治疗包括癌症在内的各种疾病。通过化学或者生物修饰，抗体还可用作为癌症的检测、诊断试剂。作为疾病诊断、治疗试剂抗体必需具备下列条件(1)诊断及治疗的抗体必须具有高亲和力、专一性，无交叉反应；(2)用作治疗试剂的抗体不能引起体内免疫反应；(3)用作体内的诊断及治疗抗体必须在37°C的生理条件下不失活、不降解、无沉淀反应。然而，从动物中获得抗体很难达到上述标准。通过动物途径获得人源抗体则难度更高，过程非常复杂。生物技术通过在体外筛选抗体可避免使用动物，使有效获得达到上述标准的抗体成为可能。重组DNA技术还可进一步开发重组序列，从而产生动物所不能产生的高功能高活性分子。由于避免使用动物，人源抗体也可以很容易获得。此外，生物技术在体外可以设计和控制筛选条件，从而产生所需抗体。例如，可用高温筛选结构稳定的抗体。 目前，常用体外生物筛选技术包括噬菌体显承、细胞表面显承及核糖体显承。基因库的大小是决定能否产生高功能高活性分子的主要因素之一。基因库越大， 多样性越大，则获得高功能高活性分子的概率也越大。目前的显承技术通常使用固定的基因库，即便是无细胞的核糖体显承技术，其基因库最大也只能达到101344分子。这一基因库大小只能任意变化10个残基((32)1°= IO14)。使用固定基因库的另一缺点是如果基因库不含有高功能高活性分子，无论使用什么样的显承技术也很难得到满意的抗体。改进办法是模拟自然进化，建立一个动态基因库，使有效的连续变异和功能筛选同时进行。专利技术概述本专利技术提供了一种制备抗体或其他蛋白质分子的方法，包括以下步骤(a)建立 DNA 文库；(b)表达所述DNA文库为可溶、游离蛋白质；(c)基于所述蛋白质的功能，筛选具有结合活性的单克隆菌或一小组克隆分子，获得其编码功能蛋白质的DNA ；(d)对上述(c)中获得的不同的DNA分子序列进行重组、重排和突变以产生新DNA 序列；(e)从(d)中新产生的新DNA序列与来自(c)中的不同DNA分子进行混合；重复(b)到(e)，直到获得理想的活性蛋白质。特别是，本专利技术涉及1.使用以下步骤获得抗体(或其他蛋白质分子)a)建立DNA文库。b)表达DNA文库为可溶、游离蛋白质。c)基于蛋白功能，筛选具有结合功能(Binding activity)的单克隆菌或一小组克隆分子，获得其编码功能蛋白质的DNAd)对上述(c)中获得的不同的DNA分子序列进行的重组、重排和突变以产生新 DNA序列。e)从(d)中新产生的新DNA序列与来自(c)中的不同DNA分子进行混合。f)重复(b)到(e)，直到获得理想(满意)的活性蛋白质。2.根据方面Ia(方面1第a项，以下采用相同规则)，DNA文库可以是独立的PCR 片断或插入到表达质粒，基因文库编码完整蛋白分子或者部分蛋白质区域。3.根据方面Ia和2，基因文库的多样性可以是来源于自然序列、人造序列或者两者(自然和人造序列)的混合。4.根据方面2和3，基因文库可以是编码单链抗体(scFv)。其多样性或者来自天然文库或者来自赋予了免疫性文库或者是两者的结合。基因库资源可以是来自任何动物， 包括人源或者动物或人与动物的混合。优先选择应是用人源抗体构架与不同来源的CDRs 混合而制备的基因库。5.根据方面lb，基因的表达或者在大肠杆菌中进行，或者在无细胞体系中进行。 采用无细胞体系进行表达时，DNA(质粒或PCR片断)可以是单一分子也可以是一小组分子， 例如50-100不同分子。6.根据方面lc，进行功能筛选时，可使用菌落滤膜筛选法(colony filter screening),或 ELI SA,或斑点印迹法(dot blotting),或蛋白芯片(protein array),或这些方法的联合使用。筛选中活性的检测可在确定的条件下进行，如采用升温、添加变性剂、改变培养时间、抑制剂等。7.根据方面ld，在功能筛选所获得DNA分子中进行序列的重组(recombination) 和重排(shuffling)时，可以通过PCR，或PCR相关技术，或其他分子生物学方法，或这些方法的联合使用来完成。基因突变也可以通过定点突变(site-directed)或者是随机突变 (random mutation)弓丨入。8.根据方面lb，供于本文涉及的基因表达体系可以是E. coli，或者是无细胞体系，或者是其他异源宿主。9.根据方面lb，表达的蛋白质或者是单体，或者是二聚体(包括共价键连接或非共价键连接的二聚体)。10.根据方面lb，蛋白质为重组抗体。11.根据方面9，表达的蛋白质可携带供检测或者纯化蛋白的标记。12.根据方面11，标记物可以是一种多肽。在表达过程中，标记物可能与蛋白质形成融合体。该多肽也可被化学基团标记。13.根据方面9，形成二聚体共价联接可通过位于蛋白质N末端或C末端或内部的一个或多个半胱氨酸残基联接。14.根据方面9，二聚体形成可以是通过蛋白质结构域(domain)或蛋白质序列 (sequence)的非共价键连接形成的。515.根据方面9，二聚体形成可以是通过交联试剂实现。16.根据方面11-12，其多肽标记序列为(H) 7LGGC，优先选择连接于蛋白质的C末端。17.抗CEA(carcinoembryonic antigen)的重组抗体，其亲和力大于 108M-1，含有表1中例举任何重链⑶Rs和轻链⑶Rs组合。18.根据方面17，对CEA具有高亲和力，专一性的重组抗体含有表1任何重链的 CDRl, CDR2, CDR3 及轻链 CDR1，CDR2, CDR3 的重新自由组合(random recombination of CDRs)。19.根据方面17-18，对CEA具有高亲和力，专一性的重组抗体，其构架来源于人源抗体构架。20.根据方面17-19，对CEA具有高亲和力，专一性的重组抗体仅含有重链。21.根据方面17-20，对CEA具有高亲和力，专一性的重组抗体包括发生在⑶Rs区或者在抗体构架区的任何突变体。22.根据方面17-21，对CEA具有高亲和力，专一性的重组抗体的大量制备可通过任何蛋白表达方法。23.根据方面17-22，其重组抗体可连接任何抗肿瘤试剂或可检测的标记试剂(如放射性标记试剂、化学发光试剂、荧光剂或者酶标试剂等)。24.根据方面17-23，其重组抗体可用于诊断体内或体外CEA含量试剂中的一种基本成分，检测的样品包括人类样品或肿瘤组织样品。25.根据方面17-24，其重组抗体可作为治疗癌症的药物。26.根据方面M，其重组抗体用于诊断体试剂包括(但不局限于)以下方式 ELISA，protein micro-arrays, dot blot，immuno-precipitation 禾口 in vivo detection。27.根据方面M，其重组抗体用于体内诊断体包括(但不局限于)肿瘤组织的定位诊断及用于抗体指导的外科手术。28.根据方面对，其重组抗体片断用于诊断试剂包括(但不局限于)与不同凝集素合用，检测诊断特定癌症病人或癌症手术后病人。29.根据方面17-22，抗CEA的重组抗体用于基因诊断及治疗。附图简述附图说明图1本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：柳红，
申请(专利权)人：英国希尔思生物分子有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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