本发明专利技术涉及医学诊断学技术领域，是一种鉴别肝癌、肝炎或肝硬化的血液小分子代谢物图谱及其制作方法。所说的小分子代谢物为4个血液代谢标志物，即棕榈酰溶血磷酸乙醇胺甘油酯，二十二碳五烯酰溶血磷酸胆碱甘油酯，二十二碳六烯酰溶血磷酸胆碱甘油酯和牛磺胆酸，它们的分子量分别为：453.2855，569.3481，567.3319，516.2916，质谱上检测到的对应离子分别是：454.2928，570.3547，568.3391，480.2776。经过动物实验，大鼠肝癌阶段的判定的准确率为85％，肝炎、肝硬化阶段的准确率为94％。临床实验表明，肝癌判定的准确率为85％，非肝癌判定的准确率为71.9％。。本发明专利技术方法具有高灵敏度、高通量的优点，优于现有的肝癌单一诊断标志物，适用于肝癌的筛查和辅助诊断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学诊断学
，是一种鉴别肝癌、肝炎或肝硬化的血液小分子代谢物图谱及其制作方法。
技术介绍
代谢组学作为后基因组时代系统生物学领域中重要的技术手段，近年来得到了长足的发展。代谢组学的着眼点在于病理刺激或者基因修饰后，细胞、组织、器官在内所有代谢物量的动态变化，从整体角度通过代谢物的变化对于疾病的发生发展进行系统描述。体液内的所有的代谢物可以作为生命系统状态的指针，不仅能够反映各种生理调节的结果， 也可以发展为辅助临床诊断的有力工具。目前，在包括癌症、糖尿病、心血管疾病等疾病的研究中发现了相应的诊断代谢标志物。而应用一组血液小分子代谢物构成的代谢谱对疾病进行诊断的方法的发展在国际上正处于一个快速的发展阶段，可能在未来对疾病的临床诊断产生重大的影响。我国有近一亿的乙型肝炎病毒感染者，以及近2000万的慢性乙型肝炎患者。在患肝炎的人群中，有着较高的肝硬化、肝癌发病率，呈现出肝炎-肝硬化-肝癌的疾病发展过程。由于肝癌恶性程度极高、预后极差、治疗成本很高，因此早期预测、预防、诊断和治疗是提高肝癌诊疗效果的最有效途径。目前对高危人群主要以甲胎蛋白(AFP)和超声、影像学相结合的诊断技术进行肝癌筛查。甲胎蛋白对于小肝癌的敏感度低，并且在肝炎及肝硬化患者存在一定的假阳性率。此外，甲胎蛋白异质体、Y-谷氨酰转肽酶同工酶II (GGT-II)、 碱性磷酸酶同工酶I、醛缩酶同工酶A(ALD-A)、岩藻糖苷酶(AFU)、抗胰蛋白酶I、异常凝血酶原、铁蛋白与酸性铁蛋白等也作为常见的肝癌诊断标志物应用于临床。但是，目前的标志物尚无法解决肝癌的早期诊断的问题，至今未见采用血液小分子代谢物图谱鉴别肝癌、肝炎或肝硬化的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于根据代谢组学这一系统生物医学领域新的理论及方法体系，建立一种由血液小分子代谢物组成的图谱及其制作方法。所说的小分子代谢物为4个血液代谢标志物，棕榈酰溶血磷酸乙醇胺甘油酯(LPE 16:0)，二十二碳五烯酰溶血磷酸胆碱甘油酯(LPC 22:5)，二十二碳六烯酰溶血磷酸胆碱甘油酯(LPC 22:6)和牛磺胆酸(TCA)，它们的分子量分别为=453. 2855,569. 3481,567. 3319,516. 2916，质谱上检测到的对应离子分别是454. 2928,570. 3547,568. 3391,480. 2776。经过动物实验，大鼠肝癌阶段(18、20周)的判定的准确率为85%，肝炎、肝硬化阶段的准确率为94%。临床实验表明，肝癌判定的准确率为85%，非肝癌判定的准确率为 71. 9%。。本专利技术方法具有高灵敏度、高通量的优点，优于现有的肝癌单一诊断标志物，适用于肝癌的筛查和辅助诊断。本专利技术图谱的制作方法如下。本专利技术包括两部分内容，首先是从动物模型中以代谢组学的方法筛选出可用于肝癌诊断的代谢标志物组，构成肝癌诊断代谢物谱；其次，进行临床样本验证以证明其诊断效果。其中，血液代谢组获取方法如下1)获取研究对象血液样本。血样为清晨餐前空腹血液(，血浆或血清均可)，采集后于4°C静置半小时、9000g 条件下离心15分钟取上清后立即储存于-80°C的冰箱中备用。2)血样预处理将样品室温解冻。取50 μ L血样加入200 μ L乙腈，剧烈震荡后与4°C静置10分钟，然后在4°C下以15000g离心10分钟，取上清4μ L进样。3)样本分析色谱分析采用的是安捷伦1200系列快速分辨液相色谱，液相色谱柱采用的是C18 柱，质谱分析采用的是安捷伦6510四极杆-飞行时间质谱。4)血液小分子代谢物轮廓获取利用软件从原始数据中提取化合物信息，并计算准确分子量。并做色谱峰匹配。匹配后的数据经过归一化以减少系统误差。用于肝癌诊断的小分子代谢物谱的筛选过程如下通过病理诊断明确的动物模型肝癌发展的各特征性阶段，以统计学方法，如多因素方差分析、Z值等寻找各阶段的特异性代谢物；并通过考察其随时间(疾病)进程的浓度变化，筛选在肝癌阶段同硬化、肝炎阶段具有显著差异的代谢物。对于差异代谢物进行进一步的过滤，以采取尽可能少的代谢物，达到更好效果为前提，最终确认4个代谢物构成肝癌诊断代谢物谱。改组代谢物对大鼠肝癌阶段(18、20周)的判定的准确率为85%，肝炎、肝硬化阶段的准确率为94%。临床样本的验证利用上述代谢物以判别分析的方法对临床肝炎、肝硬化以及肝癌患者进行鉴别。 该方法实现肝癌判定的准确率为85%，非肝癌判定的准确率为71. 9%。优于现有的肝癌单一诊断标志物。同时，本方法具有良好的扩展性，可以通过加入新的代谢标志物提高相应的判断能力。本方法同时适用于其它疾病早期诊断标志物的开发，同时，发现的标志物组具有开发成为诊断试剂盒的前景。附图说明图1本专利技术小分子代谢物图谱的4个代谢物在动物模型中的变化趋势图。A =LPC 22:5，B :LPE 16:0，C :TCA，D :LPC 22:6图2本专利技术小分子代谢物图谱在鉴别临床肝癌与肝炎肝硬化样本中的应用。其中，non-HCC组包括肝炎及肝硬化样本150例，HCC组为149例肝癌样本。具体实施例方式从动物模型中筛选可用于肝癌鉴别诊断的代谢物图谱。1、动物模型建立与血清采集处理研究对象为二乙基亚硝胺(DEN)诱导的SD(Sprague-DawIey)大鼠肝癌模型。大鼠6周龄，体重在120-150克，购自于中国科学院上海实验动物中心。饲养在SPF级环境中， 光照时间为早9点到晚9点，温度保持在22士2°C，相对湿度在45% -60%。在整个实验过程中，所有动物保持随即喂养。模型大鼠分为两组，其中10只用于诱导HCC。二乙基亚硝胺按照70mg/kg胃内灌注给药，每隔一周给药一次，连续十次。另有10只大鼠作为对照组同时饲养。根据组织病理学检查所见，大鼠肝脏的癌变过程包括下列几个显著的阶段6-8 周，感染阶段，9-15周，硬化阶段，16-20周，肝癌阶段。血清样品预处理每隔一周收集大鼠血浆样品200μ L，保存于-80°C冰箱内至分析前。模型组与对照组共采集样本160例。时间点包括，6周，8周，10周，12周，14周，16 周，18周以及20周。分析前，将样品从冰箱取出，室温解冻。取50yL血清加入200yL乙腈，剧烈震荡后与4°C静置10分钟，然后在4°C下以15000g离心10分钟，取上清4yL进样。2、血清代谢轮廓分析方法2. 1液相色谱质谱分析(1)色谱条件采用的是安捷伦1200系列快速分辨液相色谱，规格为IOcmX 2. Imm 1.8ym ZORBAX TM SB-AQ C18，柱温度50°C。流动相A是含有0. 1 %甲酸的水，流动相B为乙腈。洗脱梯度为2% B起始，保持1. 5分钟后在4分钟内升至30%，随即在25分钟达到 100%。保持4分钟后进行柱平衡5分钟。流量为0. 4mL/min。进样量为4 μ L。(2)质谱条件质谱条件为质谱分析采用的是安捷伦6510四极杆-飞行时间质谱。质谱在正离子模式下进行数据采集。质谱毛细管电压设为4000V，干燥气流量为IlL/ min，温度为350°C。喷雾压力设为45psig。Fragmentor电压和skimmer电压分别设为230V 和65V。嘌呤和六膦嗪(hexakis phosphaz本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王红阳，许国旺，谈冶雄，尹佩源，汤靓，
申请(专利权)人：中国人民解放军第二军医大学，中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：
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