生产还原型谷胱甘肽的重组菌株及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种产谷胱甘肽重组菌株，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。本发明专利技术提供的菌株切断了半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，同表达gsh1和gsh2基因的对照菌株相比达到相同产量时，可以大大提高外源半胱氨酸转化效率和缩短发酵时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物生物
，涉及发酵产谷胱甘肽的微生物及其制备方法。
技术介绍
谷胱甘肽(GSH)是生物体内一种重要的非蛋白巯基化合物，在医学和化妆品，食品加工，蛋白纯化等领域有着广泛的应用。自上世纪70年代日本协和公司(Kyowa Hakko Kogyo Co.)使用发酵法生产谷胱甘肽工业化以后，发酵法生产GSH就成为其工业生产研究的主要方法。为此，上世纪七十年代后，各国开始对生物法合成GSH进行了大量研究，发表了大量文章和申请并公布了一系列相关专利 其中，发酵菌株的选育主要集中在酵母(如 Saccharomyces cervisiae、Pichia pastoris、Candida utilis)禾口大肠杆菌等微生物，通常的方法是在育种中利用基因重组技术使微生物细胞表达GSH相关合成相关基因谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl和谷胱甘肽合成酶gsh2基因，打破转录调控，使细胞内 GSH合成酶活增加，从而提高GSH产量。谷胱甘肽作为细胞内重要的多功能因子，其合成与调控等机理复杂。Alfafara等人研究表明，胞内半胱氨酸的浓度是GSH合成产量的限制因素 。发酵添加半胱氨酸直接提高 GSH 的产量。GSH 的生产中如果增加细胞内的半胱氨酸相对含量、就可以减少外源半胱氨酸添加量，提高半胱氨酸转化率，生产成本将会大大降低。
技术实现思路
本专利技术首先提供一种生产谷胱甘肽的重组菌株。本专利技术还提供所述重组菌株的制备方法。本专利技术还提供所述重组菌株在发酵生产谷胱甘肽中的应用。本专利技术提供的生产谷胱甘肽的重组菌株，其谷胱甘肽合成转录调控失调，并且其半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因被失活或敲除。3 本专利技术中谷胱甘肽合成转录调控失调，可以采用组成型或诱导型启动子表达谷胱甘肽相关合成酶，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶正调控蛋白。谷胱甘肽相关合成酶可以选择来源各种生物的谷氨酰半胱氨酸合成酶gshl或突变体和谷胱甘肽合成酶gsh2或突变体，如酵母、大肠杆菌、高等动植物等，也可以选择双功能酶gshF或其突变体，如多杀巴斯德菌(Pasteurella multocida)的gshF基因。本专利技术中谷胱甘肽合成转录调控失调，也可以表达谷胱甘肽相关合成酶基因转录正调节蛋白(如Yaplp、Met4)启动谷氨酰半胱氨酸合成酶和谷胱甘肽合成酶基因转录。 优选的，所述的重组菌选择真菌，特别是酵母菌，在本专利技术中最优选为毕赤酵母。在本专利技术重组菌株的一个优选实施方案中，其内源的半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径上的基因和/或被失活或敲除，更优选的，Str3基因被失活。本专利技术提供的所述重组菌株的制备方法，以毕赤酵母为出发菌株为例，表达来源于大肠杆菌gshl和gsh2并且基因失活为例，包括如下步骤1)将大肠杆菌gshl和gsh2的表达盒转化到毕赤酵母中，获得表达大肠杆菌gshl 和gsh2基因的毕赤酵母。2)将步骤1)获得的毕赤酵母通过同源重组失活内源的基因，从而获得表达谷胱甘肽合成失调，半胱氨酸向高半胱氨酸的循环途径被切断的新菌株。本专利技术中基因表达可以采用商业化表达系统，也可以采用改造表达系统；表达载体可以选择游离质粒，也可以选择整合基因组。本专利技术中基因表达启动子可以选择诱导型启动子，也可以选择组成型启动子或其突变体，以酵母菌为出发菌株优选为GAP，YPT1，PGK， ADHl，TEF, HXK2等启动子中的几种或一种。在本专利技术中菌株的相关基因突变或修饰可以通过同源重组-反筛选基因修饰技术，也可以转座技术来构建多基因突变或修饰。本专利技术的微生物菌株用于本领域已知的方法在发酵罐内制备谷胱甘肽。举例言之，所用的碳源可以是葡萄糖、淀粉糖、糖蜜或其他糖类，而所用氮源可以是铵或蛋白水解物。举例言之，所用的硫源可以是硫酸盐和含硫氨基酸等。在本专利技术发现，表达gshl和gsh2基因的重组菌株，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，虽然可以达到一定产量，但是存在半胱氨酸转化效率低下。当切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环，在添加外源半胱氨酸的情况下合成谷胱甘肽，同表达gshl和gsh2基因的对照菌株相比达到相同产量时，可以大大提高外源半胱氨酸转化效率和缩短发酵时间。使用本专利技术的方法构建的微生物菌株发酵培养，其谷胱甘肽的产量显著高于目前报道的谷胱甘肽发酵生产的最高水平，提高了原料利用效率，降低了生产成本，可用于工业化生产。附图说明图1为ρ Pic G1G2的质粒图谱。图2所示为失活切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环。图3所示为str3基因失活突变过程示意图。图4所示为切断半胱氨酸向高半胱氨酸循环途径对发酵生产GSH的影响。具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在下实施例中未注明的具体的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆实验手册》、《pichia protocols》(Humana Press)中所说的方法或厂商提供的方案进行。本专利技术实施例中，毕赤酵母表达系统(包括=Pichia pastoris X33、pPIC3. 5K、 pGAPZB、pGAPZC 等)、合成引物等购于 invitrogen 公司，其中 Pichia pastoris X33 为出发菌株。KOD聚合酶、PCR纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒、DNA抽提试剂盒、碱性磷酸酶、 部分限制性内切酶、DH5ci、G418、ZeCOin、氨苄等购于上海悦克生物科技有限公司；Taq酶、 T4连接酶、部分限制性内切酶、质粒PMDT-18、质粒PUC18购于Takara公司；同源重组-反筛选系统质粒PPicZ mazF(A0Xl-mazF-Zeocin，图3)是本实验室参照文献方法构建。试剂除特殊要求外，均为国产试剂。电转参照pichia expression Kit手册中提供方法进行。实施例1谷胱甘肽合成转录调控失调菌株X33 (gshl, gsh2)的构建1)引物gshl-Ι tgaaGGTACCTTGATCCCGGACGTATCACAGGC(SEQ ID No. 1)gsh 1-2 :atgaTCTAGAATCAGGCGTGTTTTTCCAGCCAC(SEQ ID No. 2)gsh2-l :atcaGAATTCATGATCAAGCTCGGCATCGTGA(SEQ ID No. 3)gsh 2-2 :attaCTCGAGTTACTGCTGCTGTAAACGTGCTTC xhol(SEQ ID No. 4)GAPG1G2-1 CGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAAC (SEQ ID No. 5)GAPG1G2-2 :GTAACCATGGAGTAGAAACATTTTGAAGCTATGGTGT(SEQ ID No. 6)2)方法本实施例采用组成型启动子GAP表达来源大肠杆菌的gshl和gsh2基因来解除GSH转录调控。具体方法如下用引物gshl-Ι和gsh 1-2PCR扩增大肠杆菌Dffia的gsh 1基因(EcoGene登录号 EG10418)，经过Kpn I、Xba I双酶切后连接相同酶切的质粒pGAPZB，得到pGAPGl ；用引物gsh2_l和gsh 2-2PCR扩增大肠杆菌Dffia的gsh 2基因(EcoGene登录号 EG10419) J^lEcoR I、Xho 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：许善峰，
申请(专利权)人：镇江市德尔生物制品研究所有限公司，
类型：发明
国别省市：