使用多功能生物素类似物的生物分子标记制造技术

新的生物素类似物，例如2-叠氮生物素，包含天然生物素的脲环和任选地包含被修饰的噻吩环，一个被修饰的侧链，其具有功能性端基，优选选自由羧酸、胺、醇、硫醇、醛和卤素组成的组，以及位于侧链其它位置的至少一个生物正交性化学反应基团。所述类似物被用于标记靶结构和生物分子，例如体内或体外的肽和蛋白。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用多功能生物素类似物的生物分子标记本专利技术涉及生物素类似物，以及使用其标记靶结构和生物分子，例如体内或体外的肽和蛋白的方法对细胞信号通路中蛋白表达、定位和/或构象变化的追踪需要创造在体内用对具有荧光基团或其他有用的探针的蛋白进行位点特异性标记的通用工具。传统的化学方法依赖于半胱氨酸或赖氨酸侧链的亲核性，但对于体内应用太过混杂。基因方法，例如与绿色荧光蛋白(GFP)融合，携带了大量负荷(GFP含有238个氨基酸)，并且在变色范围和分光镜读出的性质上很有限。最近几年，引进了许多用于把小分子探针位点特异性地加到具有特定的肽序列的蛋白上的方法，包括 TetraCys/FlAsH 体系(B. A. Griffin, S. R. dams, R. Y. Tsien, Science, 1998，281，269-272)，HexaHis 标记(S. Lata, Μ. Gavutis, R. Tampe, J. Piehler, JACS，2006， 128,2365-2372),以及 polyAsp 标签(H. Nonaka，S. Tsukiji, A. Ojida, I. Hamachi, JACS, 2007，129，15777-157779)。多种酶介导的标记体系也被报道，包括那些使用分选酶A/ SorTag 的(M. W. Popp, J. M. Antos, G. M. Grotenbreg, E. Spooner, H. L. Ploegh, Nature Chem. Biol. 2007,3, 707-708 ；Τ.Tanaka,Τ. Yamamoo,S. Tsukiji,Τ. Nagmune,CemBioChem, 2008,9, 802-807)，使用转谷氨酰胺酶 /Q-tag 的(C. W. Lin, Α. Y. Ting, JACS, 2006，128，4542-4543)， 使用生物素连接酶的(I. Chen，Μ. Howarth, W. Lin, Α. Y. Ting, Nature Methods，2005，2， 99-104 ；M. Howarth, K. Takao, Y. Hyashi, A. Y. Ting, PNAS，2005，102,7583-7588 ；M. Howarth et al. Nature Methods，2006，3，267-273)以及使用硫辛酸连接酶的(M. Fernandez-Suarez et al. Nature Biotech. 2007,25,1483-1487 ；H.Baruh, S.Puthebveeti1, Y.A.Choi, S. Shah, Α. Y. Ting, Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 2008，47，7018—7021)。许多天然酶演变了底物特异性标记以实现其生物学功能。一个实例是大肠杆菌酶生物素连接酶(BirA)，其参与将来源于重碳酸盐的CO2转化为有机酸以形成多种细胞代谢物(Chapman-Smith et al. J. Nutr. 129 :477S_484S，1999)。其在细菌中只有一种天然底物生物素羧基载体蛋白(BCCP)，其使赖氨酸122生物素化以使其准备被重碳酸盐羧化。 Schatz等使用肽筛选确定了能够被识别并且被BirA酶促生物素化的最小的，15个氨基酸的月太·歹IJ (Schatz et al. Biotechnology 11 1138-1143,1993 ；Beckett et al. Protein Sci. 8 921-929,1999.)。上述 15 个氨基酸的序列 TTNWVAQAFKMTFDP (SEQ. ID No. 19)是最有效的从噬菌体展示文库中发酵生物素连接酶的15个氨基酸受体肽序列(I. Chen，Y.-Α. Choi and A. Y. Ting，J. Am. Chem. Soc. 2007，129，6619)。将这个被称为〃 Avi_Tag 〃 的改性序列引入感兴趣的蛋白从而在体外或活菌中进行位点特异性生物素化的纯化的BirA和克隆载体是有售的。(Avidity，Boulder, Colo. USA)是一个源自肺炎克雷伯菌BCCP的72 个氨基酸的序列，由Irwitrogen以商品名BioEase 提供。BioEase 表达体系提供了一种表达、纯化以及检测生物素化重组蛋白的方法。BioEase 载体包括一个源自肺炎克雷伯菌草酰乙酸脱羧酶的72个氨基酸的序列，其能够在体外指导特定赖氨酸残基的生物素化。载体上制得的蛋白被表达为带有这个序列的融合蛋白。生物素(维生素H或B7)以及其类似物在以前也被描述涉及在体内或体外标记肽和蛋白。已知BirA能高选择性地连接酮生物素到包括在特定的15个氨基酸序列中的赖氨酸的 α-氨基上(Chen et al Nature Meth. 2005,2,99-104 ；McNeill et al. Organic Lett. 2006 8，4593-4595)。使用酮生物素的问题在于在缺乏酶BirA时，酮基也相对活泼， 导致其与生物素连接酶或反应体系中的其它蛋白上的赖氨酸侧链反应。而且，该化合物被发现产生一个抑制BirA连接产率到 50%的产物。其它的生物素类似物也被制备出来。除其他外，Ting还等制备了，特别是脱硫生物素叠氮化物、顺-N-炔丙基生物素、以及反-N-炔丙基生物素，并且将这些作为来源于多 f ·禾中白勺白勺(Human, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus subtilis,Pyrococcus horikoshii,Trypanosoma cruzi,Glardia Iambiia,Methanococcus jannaschii 禾口 Escherichia coli (BirA)(Slavoff et al.J.Am. Chem. Soc. ,2008,130, 1160)。据证明，酿酒酵母酶可以使用顺-N-炔丙基生物素，而超嗜热古菌酶可以使用脱硫生物素和顺-N-炔丙基生物素作为底物。然而，这些类似物没有以与天然生物素同样的水平加成到15-氨基酸受体肽上。此外，由于生物素上的正交基团的位置，可以预料这些生物素类似物对抗生物素蛋白、链霉亲和素、抗生物素标记抗体或其它与抗生物素连接的蛋白仅具有低亲合力。一旦与适合的反应物反应，这些分子可能表现出对这些蛋白更低的亲合力。本专利技术的一个目的是提供一种新的生物素类似物，其为生物素连接酶的底物，并且以可接受的，理想的与天然生物素接近的效率水平，加成到特定的肽上。本专利技术进一步的目的在于提供一种新的生物素类似物，其具有可接受的，优选可逆的，与抗生物素蛋白、链霉亲和素、或它们的其它突变体或同系物的结合亲合力。本专利技术更进一步的目的在于提供一种新的生物素类似物，其与到目前为止制备的生物素类似物相比通过更少的步骤和/或更高的产率更容易地合成。本专利技术的另一个目的在于提供一种采用新的生物素类似物作为亲和标签或进一步连接分子探针的共价连接特异性位点标记靶生物分子结构，例如蛋白质和肽的方法。因此，本专利技术的第一方面提供了一种生物素类似物，其包含天本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：尼尔·R·托马斯，杨·永青，威廉·C·德鲁，
申请(专利权)人：诺丁汉大学，
类型：发明
国别省市：