本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及一种从小麦品种济南13中获得的，参与小麦叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、甾醇和植物毒素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因甲羟戊酸激酶基因TaMVK的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性的体外检测技术。为进一步构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及一种从小麦品种济南13中获得的，参与小麦叶绿素、类胡萝卜素、细胞分裂素、脱落酸、赤霉素、长萜醇、类萜、辅酶Q、留醇和植物毒素等类异戊二烯物质合成的关键酶基因甲羟戊酸激酶基因TaMVK的分离克隆、酶蛋白的原核表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性的体外检测技术。
技术介绍
类异戊二烯物质存在于所有生物体中，在植物中含量尤其丰富，是维持植物生长发育、光合作用等所必需的重要有机物质。目前，已经发现了 3万余种植物类异戊二烯， 而且这个数字还在逐年增加。该类物质在生物体中具有各种不同的作用，可作为光合色素 (如叶绿素、类胡萝卜素)、生长物质和植物激素(细胞分裂素、脱落酸、赤霉素和油菜素内酯)、膜结构的一部分如谷留醇、电子传递受体如质体醌、作为葡萄糖基化反应中葡萄糖的受体如多萜醇，并能调控细胞的生长(如异戊烯基蛋白，细胞分裂素)。此外，很多植物类异戊二烯还具有重要的商业价值如作为食物香料、饮料、维生素A、D、E，天然杀虫剂如除虫菊素和橡胶等。类异戊二烯物质的生物合成主要由甲羟戊酸途径中的一系列酶酶促合成的，甲羟戊酸激酶(MVk，MK ；ATP :mevalonate-5-phosphotransferase ；EC2. 7. 1. 36)是该代谢途径中三个连续ATP依赖酶中的第一个，它将ATP γ位上的一个磷酸基团转移到甲羟戊酸第5 位的羟基上形成甲羟戊酸-5-磷酸，并伴随着ADP的释放，是控制整个代谢途径的限速酶之一。目前已分别从拟南芥(Arabidopsis thaiiana)、水稻(Oryza sativa)、玉米(Zea mays)、高梁(Sorghumbicolor)、檢胶(Hevea brasiliensis)、蓖麻(Ricinus communis)等植物中分离克隆了甲羟戊酸激酶基因，但是现有技术中还没有成功的从小麦品种中分离出甲羟戊酸激酶基因的先例，因此制约了克隆甲羟戊酸激酶基因在小麦生产中的应用。在本专利技术申请之前，还没有公开或发表过关于从任何一种小麦(Triticum aestivum)品种中分离克隆甲羟戊酸激酶基因TaMVK、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数等研究资料信息。
技术实现思路
针对现有技术中在小麦中甲羟戊酸激酶基因相关技术的缺失，本专利技术的专利技术人提供了一整套关于小麦，特别是小麦品种“济南13”甲羟戊酸激酶基因TaMVK克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术。测得自小麦品种济南13克隆获得的甲羟戊酸激酶的Vmax为24. 6士3. 2ym0l/min/mg，Kcat 为 7. 2士0. 9S、Kcat/KM 为 5. 9xl0VS_1,甲羟戊酸的 Km 值为 1227士351 μ M，ATP 的 Km 值为对7. 5士73. 4μΜ，证明克隆的小麦甲羟戊酸激酶基因具有天然生物学活性。本专利技术为进一步构建甲羟戊酸激酶基因的真核生物基因表达载体并转化相应作物，尤其是靠次生代谢获取重要商业价值的植物，探讨甲羟戊酸激酶基因在受体植物中的过量表达与次生代谢产物、籽粒大小及粒重等重要农艺性状的关系，进而提高农作物产量，以及对甲羟戊酸激酶基因内含子、外显子及启动子结构进行剖析，研究启动子功能、开发有关分子标记提供重要技术储备。本专利技术所提供的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK编码区基因序列如kq ID No:l所示，其编码的氨基酸序列如ID No:2所示。上述的小麦甲羟戊酸激酶基因TaMVK是从小麦品种济南13中克隆获得的，该基因 cDNA总长为1752bP，翻译起始密码子ATG自273位核苷酸开始，终止密码子TAA位于1437 位核苷酸处，在1734位核苷酸处有polyA尾巴。因此，小麦品种济南13TaMVK全长cDNA包括1个27!3bp的5'非编码区、1167bp编码区和1个3'非编码区，编码一条包含388aa的多肽，分子量约为46kDa。专利技术人进一步公开了该基因的分离克隆、编码蛋白酶的原核基因表达、酶蛋白的分离纯化及其酶活性体外检测和动力学参数测定的技术，具体如下具体的分离克隆方法为1.小麦叶片RNA的分离提取根据TaKaRa广谱型total RNA提取试剂盒(Takara RNAisoTm Plus)的说明书进行。获得的RNA保存在DEPC水中备用。2. cDNA第一条链的合成按照PrimeScriptTm 1st Strand cDNA Synthesis kit 的说明书进行合成。3.基因中间序列扩增、连接与转化根据已知部分小麦MVK的EST序列，用ft~imer5. 0引物设计软件和DNAMAN软件设计引物，上游引物为WmvkF :5' GTTGGCGGAACGGAGTGGCA 3'，基因序列如kq ID No :3所示；下游引物为WmvkR :5' CGACTTTGAAGCAGCGGAAACCAT3‘，基因序列如 kq ID No :4 所示。进行 PCR，利用 DNA胶回收试剂盒 TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2. 0 回收特异条带。将回收的DNA片段和pGEM-T Easy Vector进行连接。利用热激法转化大肠杆菌 DH 5 α，挑取阳性克隆，制备质粒DNA并进行DNA测序，通过NCBI比对获得目的基因片段。4.利用RACE技术快速获得基因末端序列4. IRACE 引物设计通过DNAMAN比对所获得的目的基因中间序列，以及橡胶(AB29469!3)、拟南芥 (X77793、NM_12^27. 4)、褐家鼠(NM_031063)、小家鼠(匪_02；3556)、玉米(BT062051. 1)、水稻(ΝΜ001070895)、高粱(XM 002453136. 1)的基因序列，寻找最保守的区域，用DNAMAN手工设计引物序列为5' RACE 引物5' CCATGCACTGGAGCAAACCTTGG 3'，基因序列如 kq ID No :5 所示；3' RACE 引物；5' TGGTAGGAACACCAAGGCTCTGGT 3‘，基因序列如 kq ID No :6 所示；4. 2基因末端序列快速扩增根据Clontech Laboratories INC 的 SMARTTm RACE cDNA Amplification kit 的方法快速扩增基因的5'和3'末端，筛选重组子，并测序。4. 3基因中间序列和RACE序列使用Contig Express 9. 1拼接全长序列，然后对所得的contig序列进行人工校对。5基因全长序列的扩增5.1基因全长引物的设计根据中间序列和RACE序列contig结果，设计全长扩增引物。上游引物序列为WfsmvkF:5' ATGGAGATCCGCGCCCGCGCGCCCGGCAAGA 3'，基因序列如kqlD No 7所示下游引物序列为MVKfslR:5' GACTGGCAAACTCGCTTATT3 ‘，基因序列如 kq ID No 8所示；5. 2全长基因的PCR扩增以第一链cDNA为模板扩增全长目的基因，进行全长基因PCR产物的胶回收、连接、 转化、PCR重组子检测、质粒提取和本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：楚秀生，王宝莲，李玉莲，樊庆琦，李永波，黄承彦，刘爱峰，高洁，隋新霞，
申请(专利权)人：山东省农业科学院作物研究所，
类型：发明
国别省市：
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