来源于链霉菌考干尼西斯的胞外透明质酸酶制造技术

本发明专利技术涉及链霉菌koganeiensis(Streptomyces?koganeiensis，ATCC?313942)透明质酸酶，该酶分子量为21.6千道尔顿(kDalton)，其活性和稳定性明显优于目前从此类微生物中所获得的其他透明质酸酶。本发明专利技术还涉及该透明质酸酶的分离与纯化过程，及其在制备药物组合物或作为分析试剂方面的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】来源于链霉菌考干尼西斯的胞外透明质酸酶
技术介绍
透明质酸酶为水解酶，它能以多种方式将透明质酸裂解为D-葡萄糖醛酸和N-乙酰氨基葡萄糖，也能降解其他结缔组织的酸性粘多糖。例如，在水蛭口器、蛇毒、蜂毒、蝎毒以及肺炎球菌、β -溶血链球菌、金黄色葡萄球菌等致病菌的培养液上清中均存在高浓度的透明质酸酶。在人体内，透明质酸酶存在于角膜、睫状体、脾脏、皮肤及睾丸内。另外，精子内也具有较多透明质酸酶，可使其能够穿过保护卵细胞的透明质酸屏障。透明质酸酶在医学上用于水肿、局部炎症反应、痔疮及冻疮的治疗，并能有助于某些活性成分进行皮下给药。另有报道称，某些透明质酸酶确实能够显著减少心肌梗死的面积。在兽医领域，透明质酸酶也用于治疗诸如牛乳腺炎等动物疾病的抗生素溶液中。此外，透明质酸酶还可用作某些生物学检测的分析试剂，例如它可以用于透明质酸的定性-定量检测。由于透明质酸酶在水溶液中不稳定并且在纯化中易失活，因此在工业规模下生产和纯化细菌或动物来源的透明质酸酶非常困难。美国专禾Ij US 4，258，134和相应的欧洲专利EP 0005751 披露了一种透明质酸酶，该酶利用透析、DEAE-及CM-纤维素离子交换层析的方法从链霉菌考干尼西斯 (Streptomyces koganeiensis, ATCC 313942)的培养上清液中获得。目前已经发现，经上述两步层析获得的蛋白质组分，实际上由多个蛋白质组成 (二维电泳显示约68个)，但其中只有一个具有较高的透明质酸酶活性和显著的稳定性。
技术实现思路
本专利技术涉及来源于链霉菌koganeiensis (ATCC 31394)的透明质酸酶，包含SEQ ID No. 1所示的N-末端氨基酸序列。该酶的特征还在于分子量为21. 6kDa，等电点(pi)在4. 4_4. 8之间，酶活性等于或高于 40，OOOIU/mgo根据本专利技术，该透明质酸酶可通过包括以下步骤的方法获得a)将发酵链霉菌koganeiensis (ATCC 31394)得到的上清液进行弱阳离子交换柱层析，分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分；b)将步骤a)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行透析及强阴离子交换柱层析，分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分；C)将步骤b)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行强阳离子交换柱层析，分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分；d)将步骤C)中获得的具有透明质酸酶活性的蛋白质组分进行强阴离子交换柱层析，分离具有透明质酸酶活性的蛋白质组分。微生物发酵可利用已知的方法进行，具体而言，可利用美国专利US 4, 258, 134所披露的方法。发酵后取上清，然后进行收集、离心和过滤。此外，根据本专利技术，在进行色谱层析步骤前，可利用本领域技术人员所公知的方法对上清液进行进一步处理，以去除培养液3中的残余颗粒。通常情况下，使用适当的聚醚砜超滤膜对上清液进行超滤富集，超滤膜截留分子量为5 15kDa，优选截留分子量为IOkDa ；通常上清液可富集8 12倍，优选富集倍数为10倍。富集后的上清液一旦被合适的检测方法(例如Dorfman改良检测法)证实具有透明质酸酶活性，则可对其进行透析；透析缓冲液根据在步骤a)中所使用的弱阳离子交换树脂进行选择，以使透明质酸酶在此PH值条件下能够与树脂结合。该树脂含有羧烷交换基团，优选为羧甲基基团，如“CM-kpharose i^ast Flow”树脂。利用透析缓冲液对树脂进行适当平衡后，将样品上样，后用相同的缓冲液进行洗脱以除去未结合的蛋白质，尔后提高缓冲液PH值直至能将结合蛋白质进行洗脱。使用“CM-kpharose i^st Flow”树脂时，采用50mM pH 4.0的醋酸钠溶液进行透析、树脂平衡及洗脱未结合的蛋白质，而对结合蛋白质的洗脱则采用50mM pH 4. 5的醋酸钠溶液。将具有高透明质酸酶活性的结合蛋白质收集为单一组分，并进行强阴离子交换柱层析。在开始进行前，可利用本领域技术人员所公知的方法对收集的单一组分进行透析，所使用的透析缓冲液能够保证透明质酸酶与步骤b)中使用的强阴离子树脂结合。此种树脂含有三烷基胺基团，一般为三甲基胺基团，如“HiTrap Q XL”树脂(5ml柱)。利用透析缓冲液对树脂进行平衡后，将步骤a)中获得的组分上样，后用相同的缓冲液进行洗脱以除去未结合的蛋白质；然后逐步提高洗脱液的离子强度以对结合的蛋白质进行洗脱。根据优选的实施方案，使用HiTrap Q XL树脂时，采用50mM pH 8的Tris-HCl缓冲液进行透析、柱平衡及洗脱未结合的蛋白质，而在洗脱结合蛋白时则向洗脱液加入浓度逐渐提高的NaCl溶液。洗脱时，首先使用50mMTris-HCl、 35mM NaCl pH 8溶液，然后使用50mM Tris-HCl,200mM NaCl pH8溶液，由此可获得两个组分，但只有使用含有200mM NaCl的洗脱液洗脱下来的第二组分才具有透明质酸酶活性。将该组分稀释8 12倍，优选稀释10倍，所用稀释缓冲液能够保证透明质酸酶与步骤c)中使用的强阳离子树脂结合。此种树脂含有磺酸基团，优选为磺酰烷基团，更优选为磺丙基团。 根据本专利技术具体优选的实施例，使用“HiTrap SP FF”树脂进行层析。就具体操作来说， 用稀释步骤b)所获得的透明质酸酶组分的稀释缓冲液平衡树脂，上样，然后用相同的缓冲液进行洗脱(约20倍柱床体积)，之后通过逐步提高洗脱液的pH值对结合蛋白进行洗脱。 一般而言，对于HiTrap SPFF树脂，稀释、柱平衡及洗涤均采用20mM pH4的磷酸钠缓冲液， 而洗脱则采用50mM pH 4. 8的磷酸钠缓冲液。将具有高透明质酸酶活性的结合蛋白质收集为单一组分，并进行强阴离子交换柱层析。通常情况下，在进行柱层析前，将该组分稀释8 12倍，优选稀释10倍，所用稀释缓冲液能够保证透明质酸酶与所选树脂结合。 步骤d)中所用树脂为含有季铵基团的强阴离子交换树脂，优选使用“Resource Q ”离子交换柱。上样后，采用平衡时所用缓冲液进行洗涤，然后以0. 5为单位逐步降低pH值直至 4以对结合蛋白进行洗脱。使用“Resource Q ”离子交换柱时，透明质酸酶组分的稀释、 柱平衡及上样后的洗涤均采用20mM pH5. 5的醋酸钠溶液，利用以上所述逐步降低pH值的方法，在PH 5时可获得第一个蛋白质组分，在pH 4时可获得另外两个蛋白质组分。如图2 所示，在PH 4进行洗脱时所得的第二组分在^Onm处有吸收，其酶活也高于其他两个组分。 将该组分进行12% SDS-PAGE电泳色谱法和银染(图6)，可观察到单一蛋白质条带，其表观分子量约25kDa。具体而言，经上述步骤纯化所得的透明质酸酶99%具有约25kDa的表观分子量，此种蛋白质只包括了发酵上清液中约5%的透明质酸酶；因此，该纯化过程达到了 20倍的浓缩，其产量约30%。对于目前已知的其他透明质酸酶而言，本专利技术所涉及的透明质酸酶在水溶液中高度稳定，对蛋白水解酶类亦不敏感，HPLC纯度高于98% (图如 证)，这些均为治疗用所必需之特性，因此，该酶可单独使用或与其他活性成分联用，以制备人用或兽用药物组合物， 用于降解器官或组织中的透明质酸，以达到治疗某些疾病的需要。由于在水本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：卢西亚诺·墨西拿，苏珊娜·瓦卡罗，萨尔瓦托雷·卡鲁松，乔瓦尼·热纳里，
申请(专利权)人：菲迪亚医药公司，
类型：发明
国别省市：