本发明专利技术公开了属于转基因植物检测技术领域的一种转基因棉花检测通用质粒标准分子及其构建方法。该质粒标准分子含有棉花内标准基因sadI，抗虫基因CryIAb/CryIAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S启动子和Nos终止子的部分序列。该质粒标准分子稳定性好、易于保存，能够作为各种转基因棉花检测的标准阳性对照。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于转基因植物检测
，具体涉及。
技术介绍
随着转基因技术的飞速发展，越来越多的转基因产品问世并大规模商业化应用。世界各国都在完善对转基因产品的安全监管。核酸检测是对转基因产品进行安全监管的有效方法之一，在核酸检测过程中，为防止假阳性的出现，必须要有标准阳性物质作为参考。目前常用的来源于纯合转基因植物的标准阳性物质在制备、贮藏和测定等方面都受很多因子影响，而且并非所有的作物转基因品系都存在这类标准阳性物质， 从而影响到对转基因产品的分子检测。因此，标准阳性物质的缺乏已成为限制转基因产品检测的主要因子之一，急需研制标准阳性物质的替代品。Taverniers等于2001年提出“单靶标质粒分子”概念，即将不同目标DNA片段分别克隆到载体上用作标准分子 (Taverniers I, Windels P, Bocktaele E V, et al. Use of cloned DNA fragments for event specific quantification of genetically modified organisms in pure and mixed food products. Eur Food Res Tethnol，2001，213 (6) :417-424)。2002 年，日本科学家Kuribara提出了质粒标准分子的概念(Kuribara H, Shindo Y, Matsuoka T, et al. Novel reference molecules for quantitation of genetically modified maize and soybean. J AOAC Int, 2002,85 (5) :1077-1089)，质粒标准分子可以通过将需检测的基因片段克隆到克隆载体上而获得，操作很简单。另外，质粒标准分子还具有纯度高、稳定性好、 易于保存等优点。经验证质粒标准分子在GMO鉴定检测中是很好的标准阳性物质替代物， 如Corbisier等构建的检测M0N810的质粒标准分子经欧盟联合研究中心标准物质方法研究所测试，最终注册并命名为有证标准物质ERM-AD413 (Corbisier P，Broeders S，Charels D, et al.Certification of plasmidic DNA containing M0N8IOmaize DNA fragments, ERM-AD413. EC certification report,2007, EUR 22948，ISBN 978-92-79-07139-3)。 因此，构建阳性标准分子已经成为国际上转基因检测领域的研究热点。目前，国外已获得多种转基因产品检测用质粒标准分子(Debode F，Marien A，Janssen E. Design of multiplex calibrant plasmids,their use in GMO detection and the limit of their applicability for quantitative purposes owing to competition effects.Anal Bioana Chem，2010，396 :2151-2164)。我国也开展了许多阳性标准分子质粒构建方面的研究，成功构建了多种阳性标准分子。如上海交通大学建立的多种阳性标准分子(Yang L Τ, Guo J C,Pan A H,et al. Event specific quantitative detection of nine genetically modified maizes using one novel standard reference molecule.J Agri Food Chem, 2007,55(1) :15- ),东北农业大学构建的转基因水稻、玉米和大豆通用质粒标准分子(敖金霞，高学军，曲波，等.转基因大豆、玉米和水稻外源基因检测通用标准分子的构建. 中国农业大学学报，2008，13(6) :19- )、吉林农科院构建的检测M0N89788的质粒标准分3子(李飞武，邵改革，邢珍娟，等.转基因大豆M0N89788检测质粒标准分子的构建与应用。 安徽农业科学，2010，38 (23) :12330-12333)，中国农业科学院油料作物研究所构建的转基因作物筛查用阳性标准分子等(胡尚杰，吴刚，武玉花，等。转基因作物筛查用阳性质粒分子的构建及应用研究。中国油料作物学报，2010,32 ) :173-179)。转基因抗虫棉已大规模商业化应用，目前市场上种植的抗虫棉主要有孟山都公司的转Bt基因的抗虫棉，以及中国农业科学院生物技术研究所研发的转Bt或CPTI的抗虫棉。上海交通大学构建的转基因棉花质粒分子主要是针对Bt设计的，尚未有检测转基因棉花的通用质粒标准分子。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，满足转基因棉花检测需求。本专利技术的目的还在于提供一种转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法。一种转基因棉花检测通用质粒标准分子，所述质粒标准分子含有棉花内标准基因 sadl，抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan， 调控序列35S启动子和Nos终止子序列。一种转基因棉花检测通用质粒标准分子的构建方法，按照如下步骤进行(1)通过GenBank数据库和文献查询，获得棉花内标准基因SadI，抗虫基因 CrylAb/CrylAc融合基因，抗虫基因CPTI，抗除草剂基因CP4，标记基因Kan，调控序列35S 启动子和Nos终止子的核苷酸序列；(2)根据获得的目的基因的核苷酸序列，设计引物，PCR获得目的基因片段；其中， SEQ ID NOl和SEQ ID N02组成的引物对扩增抗虫棉获得棉花内标准基因sadl，SEQ ID N03 和SEQ ID N04组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因，SEQ ID N05和SEQ ID N06组成的引物对扩增抗虫棉获得抗虫基因CPTI，SEQ ID N07和SEQ ID N08 组成的引物对扩增抗除草剂棉花获得抗除草剂基因CP4，SEQ ID N09和SEQ ID NOlO组成的引物对扩增抗虫棉获得Nos终止子序列；(3)将步骤⑵获得的棉花内标准基因MdI PCR产物与T-载体连接形成中间载体 pGhsadl ；(4)采用Overlapping PCR技术，以步骤⑵获得的抗虫基因CrylAb/CrylAc融合基因和抗虫基因CPTI的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CrylAb/CrylAc-CPTI融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCPTI-Bt ；(5)采用Overlapping PCR技术，以步骤⑵获得的抗除草剂基因CP4和Nos终止子部分序列的PCR产物为模板进行PCR扩增，获得CP4-NOS融合基因片段，并与T-载体连接形成中间载体pCP4-Nos ；(6)采用EcoRl和Kpnl双酶切载体pCAMbia2300和中间载体pCPTI_Bt本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王旭静，王志兴，唐巧玲，
申请(专利权)人：中国农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：
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