本发明专利技术公开了一种基于共聚焦拉曼显微技术测定植物细胞壁木质化程度的方法，本发明专利技术方法包括在原位状态下利用共聚焦拉曼显微镜对植物细胞壁进行拉曼光谱的测定，获得细胞壁内木质素的拉曼光谱成像图，根据拉曼信号强度确定细胞壁内木质素含量，确定不同类型细胞次生壁以及纤维细胞壁不同形态区域木质化程度。本发明专利技术测定方法基于纯粹的光谱方法，制样快速，不产生化学污染物，可在原位状态下获得植物细胞壁木质化程度的信息。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及拉曼光谱结合共聚焦显微镜技术在研究植物细胞壁木质化程度方面的应用，特别涉及在原位状态下采用785nm激发波长的共聚焦拉曼显微镜测定植物细胞壁木质化程度的方法。
技术介绍
木质纤维原料被认为是可持续循环利用的燃料和化学品资源，其细胞壁是由纤维素、半纤维素和木质素组成的类似于钢筋混凝土的坚硬层状结构，这三类聚合物大分子占细胞壁生物质总量的90%以上。其中木质素是存在于维管植物中复杂且无规律的多酚聚合物，它增强细胞壁结构完整性的同时也抑制了微生物对细胞壁的腐蚀。而其结构和功能的复杂性一直是制约生物质转化的瓶颈。随着植物木质化过程的进行，细胞壁中沉积了大量的木质素，这些木质素在化学法制浆过程中如硫酸盐法，溶解在黑液中，若不能回收利用将会对环境造成严重污染；在生物质转化过程中，木质素的存在也会抑制单糖发酵生成生物乙醇。研究清楚细胞壁的木质化程度差异可为植物生理学提供理论依据，通过调节木质素的生物合成控制木质化作用，达到降低植物细胞壁中木质素含量的目的，对优化造纸原料及提高细胞壁组分的分离转化效率具有重要的理论及应用意义。因此研究植物细胞壁木质化程度差异是十分必要的。研究细胞壁木质化程度的传统方法主要有扫描/透射电子显微镜结合能谱(SEM/ TEM-EDXA)法、紫外显微镜(UV-Microscopy)法、共聚焦激光扫描电子显微镜(CLSM)法等， 这些方法通常要对植物组织切片进行染色处理，由于染色剂与细胞壁不同区域的反应活性存在差异，因此不能真实反映细胞壁木质素沉积的原始信息。和Goring利用溴染色扫描电子显微镜结合能谱以及紫外显微镜法研究云杉细胞壁木质化程度发现由于细胞角隅区和次生壁区域木质素与溴反应活性的差异，造成溴染色扫描电子显微镜结合能谱法与紫外显微镜法测得的两区域木质素浓度比值相差1. 7倍。除此之外，这些方法也不能够揭示植物组织细胞壁木质素分子结构方面的信息。传统方法中用于揭示植物细胞壁木质素分子化学结构信息的技术主要包括红外光谱(IR)、紫外光谱(UV)、气相色谱-质谱联用(GC-MAS)以及核磁共振波谱(Mffi)。这些方法首先要将木质素通过化学试剂从细胞壁中先分离出来然后进行测定。而当木质素分子通过化学方法分离或是溶解后，部分分子结构信息会发生变化甚至丢失。拉曼光谱结合共聚焦拉曼显微技术因其样品制备简单，具有较高的光谱和空间分辨率，能够有效的解决上述问题。拉曼光谱类似于红外光谱是基于分子振转能级变化的散射光谱。区别于红外光谱的是拉曼光谱能够在样品含水条件下测定样品的分子结构信息， 结合显微技术后大大增进了拉曼光谱的空间分辨率，使得在原位状态下研究细胞壁各层木质化程度差异成为可能。获得的细胞壁各层的振动光谱中包含了木质素分子的结构信息。从中国知识产权局专利检索数据库的检索表明，国内有关拉曼光谱的专利共有77 项，绝大部分集中在单独使用拉曼光谱仪及其某些部件的研制方面。国内尚未见关于拉曼显微镜技术研究植物细胞壁木质化程度差异的专利。此外，Google网上检索及其他文献检索途径表明，目前国内外还未见到利用拉曼光谱技术结合共聚焦显微镜技术测定植物细胞壁木质化程度的研究报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的问题，提供一种在原位状态下利用拉曼显微技术测定植物细胞壁木质化程度的方法。本专利技术方法快速，简便，测定结果准确，能够为木质纤维原料的筛选、树木转基因研究等迅速提供准确地反映植物细胞壁的木质化程度的信肩、ο为实现本专利技术的目的，本专利技术一方面提供，在原位状态αη-situ)下利用共聚焦拉曼显微镜对植物细胞壁进行拉曼光谱的测定， 获得细胞壁内木质素的拉曼光谱成像图(Raman images)，根据拉曼信号强度确定细胞壁内木质素含量。其中，所述采用共聚焦拉曼显微镜测定拉曼光谱的过程中激发波长为785nm。本专利技术另一方面提供，包括如下顺序进行的步骤1)将植物木质化组织切成长方体样品块后置于水中进行浸泡处理，制得软化材；2)沿着软化材的横截面方向将其切成厚度为18-27 μ m的样品薄片；3)将样品薄片固定在载玻片上后置于共聚焦拉曼显微镜下，对植物细胞壁进行拉曼光谱的测定，获得细胞壁内木质素的拉曼光谱成像图，根据拉曼信号强度确定细胞壁内木质素含量。其中，步骤1)中所述的长方体样品块的大小为lcmXO. 5cmXlcm0特别是，所述样品块的大小为Icm(顺纹方向)X0. 5cm(弦向)X Icm(径向，厚度方向)。其中，步骤1)中所述浸泡处理的水的温度为100士5°C ；浸泡处理的时间为 30_45mino特别是，针叶木类样品块的浸泡时间为30min;阔叶木类样品块的浸泡时间为 45min。其中，步骤2)中所述样品薄片的厚度优选为20-25 μ m。特别是，所述样品薄片在进行拉曼光谱检测是在积分的区域为观00 3000cm-1范围内，样品薄片的细胞次生壁的拉曼信号强度差异< 10 %。其中，步骤3)中所述拉曼光谱测定过程中激发波长为785nm。特别是，所述拉曼光谱测定过程中透光针孔的直径为100 μ m。特别是，采用环氧树脂胶将样品片固定在载玻片上后，再置于共聚焦拉曼显微镜下，进行拉曼光谱测定。特别是，还可以采用指甲油固定所述样品片于载玻片上。其中，拉曼光谱的采谱范围选择在250 3250CHT1。特别是，木质素成像时选取的积分范围为1580 1660CHT1，此范围内主要包括 1606cm—1处木质素苯环C = C的伸缩振动特征峰，1655cm—1处松柏醛C = O的伸缩振动和松柏醇C = C的伸缩振动特征峰。特别是，还包括步骤2-1)将步骤幻中所述的样品薄片置于荧光消除剂中进行浸泡处理，制得消除荧光的样品片后再进行所述拉曼光谱测定。其中，所述荧光消除剂为硼氢化钠溶液，硼氢化钠能与细胞中含有羰基(C = 0)的组分发生反应，进而将羰基还原，达到减弱、消除荧光的目的。特别是，所述硼氢化钠溶液的质量百分比浓度为1. 0-1. 5% ；所述浸泡处理时间为 5-7min。本专利技术与现有技术相比，具有如下优点1.本专利技术方法样品制备简单，仅需切取厚度为18-27 μ m的植物木质化组织的横切面便可进行共聚焦拉曼显微观察；2.本专利技术方法建立的共聚焦拉曼显微镜测定方法可以在水溶液状态下对样品进行分析，克服了红外光谱对样品制备的限制；3.本专利技术方法能够获得细胞壁木质素分子结构信息，补充了红外光谱中遗失的分子结构信息；4.本专利技术方法该选择波长为785nm的激光作为激发光源，可以显著降低生物样品的荧光干扰，结合共聚焦显微镜技术后能够在原位状态下测定植物不同类型细胞次生壁以及纤维细胞壁不同形态区域木质化程度的差异。5.本专利技术方法测定过程中不需要经过任何的化学处理(染色、包埋)，避免了化学试剂与不同木质素结构单元反应活性差异对木质素含量测定的影响，保证了样品中木质素含量测定的准确性，为原位测定提供准确的信息。6、本专利技术方法在进行拉曼光测定之前对样品进行消除荧光处理，降低了样品中荧光的干扰，保证了样品中木质素含量测定的准确性，为原位测定木质纤维材料中木质化程度提供准确的信息。说明书附1是红瑞木(Cornus alba)纤维细胞壁不同形态区域木质化程度差异共聚焦拉曼成像图(Raman images)。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马建锋，张智衡，毛健贞，许凤，孙润仓，
申请(专利权)人：北京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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