本发明专利技术公开了一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒及应用，该试剂盒含有：a）兔来源的抗人Interleukin-17F（IL-17F）的抗体，b）生物素标记的羊抗兔IgG；c）亲和素标记的HRP；d）正常山羊血清封闭液；e）3%体积比H2O2；f）DAB显色液；g）苏木素。该检测具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞。IL-17F在正常结肠组织上皮细胞中呈阳性表达染色，而在癌变细胞上皮中呈阴性表达。有效地区分结直肠癌变的上皮细胞和正常细胞，为临床的诊断和治疗提供参考依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，更具体涉及一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，同时还涉及一种用于结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒的用途。
技术介绍
结直肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，占胃肠道肿瘤的第3位。我国的发病率与死亡率，随着人民生活水平的提高，饮食结构的改变，呈逐年上升的趋势。结直肠癌已经成为威胁人类生命和健康不容忽视的疾病。结直肠癌起病隐匿，早期症状不明显，许多患者在确诊时已经处于晚期。大约25%的患者初次就诊时就已经发生转移，另外，40% -50% 新诊断患者将继续发展出现转移。仅仅少于5%的患者能存活5年以上。因此，深入对结直肠癌的基础研究和提高结直肠癌的诊断率，对提高结直肠患者的生存率、降低其病死率具有相当重要的临床意义。目前用于结直肠癌的诊断的方法包括大便潜血试验、内窥镜检查、影像学检察、分子生物学检查以及病理组织学检查。目前在结直肠癌诊断技术中，不同的检查手段是从不同侧面不同程度反映了区别于正常组织的肿瘤形态。单一的检查手段并不能明确病情，需要结合实际情况，选择多种检查手段才能做出判断。其中病理诊断也是结直肠癌诊断中最可靠的诊断，是明确诊断以拟定治疗方案所必需的依据。常规的病理形态学检查包括脱落细胞学检查和活体组织检查。由于结直肠中脱落细胞常有不同程度的变性，阴性结果并不能否定肿瘤的存在，临床上结直肠癌脱落细胞学检查应用范围非常有限，主要依靠组织病理学检查明确诊断。免疫组化是最近10多年来迅速发展起来的一门新兴技术。它已被广泛运用肿瘤研究和诊断，其原理是利用抗原与抗体的特异性结合反应来检测组织中的未知抗原或者抗体，主要是肿瘤相关抗原(肿瘤分化抗原和肿瘤胚胎抗原)，借以判断肿瘤的来源和分化程度，协助肿瘤的病理诊断和鉴别诊断。目前常用的染色方法有过氧化物酶-抗过氧化物酶法，艮口 PAP法(peroxidaseantiperoxidase technique)禾口卵白素一生物素_过氧化物醇复合物法，艮 P ABC 法(avidin-biotin—peroxickse complex technique)。禾 O 用免疫组织化学方法已经可以对许多常规方法难以判断其来源的肿瘤加以鉴别。例如检测细胞骨架的中间丝(intermediate filament)，其直径平均为10nm，介于微管和微丝之间。中间丝有五类即神经原纤维、胶质原纤维酸性蛋白、结蛋白(desmin)、波形蛋白(vimentin)和角蛋白 (keratin)。它们各有生物化学和免疫学特性，并分别存在于不同类型的细胞中，故具有相对的特异性，可用来协助诊断相应的神经细胞、神经胶质细胞、横纹肌和平滑肌、间叶组织和上皮细胞来源的肿瘤。目前能用于肿瘤辅助诊断和鉴别诊断的抗体已不胜枚举。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，该抗体检测具有高灵敏性，高特异性和高准确性的特点，不仅可以区分癌变组织和正常组织，还可以区分癌变组织中癌变的细胞和正常的细胞。IL-17F在正常结肠组织上皮细胞中呈阳性表达染色，而在癌变细胞上皮中呈阴性表达。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种用于结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒在临床流行病学调查中的应用，有效地区分结直肠癌变的上皮细胞和正常细胞，为临床的诊断和治疗提供参考依据。为了实现上述目的，本专利技术采用以下技术措施一种结直肠癌的免疫组织化学染色检测试剂盒，该免疫组织化学染色试剂盒含有a)兔来源的抗人hterleukin-17F(IL-17F)的抗体，b)生物素标记的的羊抗兔IgG ；c) 亲和素标记的HRP ；d)正常山羊血清封闭液；e)3% (体积比) ；f)DAB显色液；g)苏木素。本试剂盒将IL-17F这一在结直肠癌患者的癌变组织中特异性低表达的细胞因子作为用于检测的参考指标。在本专利技术中关键是兔来源的抗人^IterleUkin-HF(IL-HF)的抗体制备，其方法包括下列步骤 A)构建 IL-17F 表达载体。试剂盒DES -Inducible/kcreted Kit with pCoHygro购自invitrogen公司。将人的免疫球蛋白IgGl的Fc片段(华盛顿大学Edward A. Clark博士友情赠送)标签克隆至试剂盒中提供的PMT/BiP/V5-HisA表达质粒中，获得果蝇表达体系-免疫球蛋白融合质粒(DES-Ig)。通过PCR的方法扩增人IL-17F的cDNA序列，克隆入 DES-Ig 质粒。B)建立稳定转染IL-17F表达载体的果蝇细胞系S2(试剂盒中提供的细胞)，硫酸铜诱导蛋白分泌表达并纯化IL-17F。按照试剂盒说明书，将上述构建成功的载体和试剂盒中提供的pCoHygro质粒共转染果蝇细胞系S2，筛选获得稳定细胞系；并用硫酸铜诱导蛋白的分泌表达。收集上清，用蛋白A-琼脂糖(Protein Α-Sepharose)柱子购自sigma公司富集纯化IL-17F-Ig融合蛋白。C)免疫兔子获得IL-17F的多克隆抗体并鉴定。具体步骤是取200ug免疫原即 IL-17F-Ig融合蛋白与弗氏完全佐剂进行1 1混合形成乳剂，注射入兔子双肩皮下和后大腿肌肉；间隔2周加强免疫，免疫原量减半，用弗氏不完全佐剂混合成乳剂注射临近部位； 再间隔2周加强免疫；注射后的第7天取血。吸取血清，离心，分装，冻存。检测抗体效价。利用本专利技术中的抗IL-17F特异性的多克隆抗体，联合免疫组织化学染色常规试剂(生物素标记的的羊抗兔IgG ；亲和素标记的HRP ；正常山羊血清封闭液；3% H2O2 ；DAB显色液；苏木素)，方便、高效、特异的辅助结直肠癌的病理检测，可作为判断患者预后的一个指标，对结直肠癌的检测，基础研究和检测提供参考，具有临床实用性和科学研究性。一种用于结直肠癌的免疫组织化学染色检测(查)试剂盒在临床流行病学调查中的应用，该试剂盒由以下物质组成a)兔来源的抗人 hterleukin-17F(IL_17F)的抗体。b)生物素标记的的羊抗兔IgG ；c)亲和素标记的HRP;d)正常山羊血清封闭液；e)3% (体积比)H202 ；f) DAB 显色液；g)苏木素；其检查步骤是1.组织用石蜡包埋，切片，石蜡切片置于58_62°C烤箱中1小时后，脱蜡至水，用 PBS (pH7. 4)冲洗2-4次，每次4_6分钟。2.抗原微波修复10mM pH 5. 8-6. 2枸橼酸钠缓冲液倒入微波修复盒内将切片放入修复液内，微波炉高火3min—中火7min—低火3min。自然冷却后至室温(20_25°C)， PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。3.切片放入3% (体积比)H2O2溶液，室温下孵育15分钟，以阻断内源性过氧化物酶。PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。4.甩去PBS液，滴加5% BSA室温28-32分钟。5.甩去BSA，第一抗体按1 100的浓度稀释。每张切片加入100 μ 1稀释液覆盖组织，4°C过夜。PBS冲洗2-4次，每次4-6分钟。6.甩去PBS液，每张切片加100 μ 1第二抗体，室温下孵育45分钟。PBS冲洗2_4 次，每次4-6分钟。7.甩去PBS液，每张切片加50-100 μ 1新鲜配制的DAB溶液，室温(20_25°C，上下相同)下孵育4-本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：董晨，童攒，
申请(专利权)人：武汉康迈生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：
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