一种血浆中多胺类物质的测定方法技术

本发明专利技术涉及对生物血浆样本中多胺类物质的检测方法，多胺是一类具有重要生理作用的内源性物质，在细胞增殖、蛋白质与核酸合成等方面起着重要作用。因此多胺的产生与癌症的发生密切相关，多胺可以作为癌症标记物应用于癌症的诊断与治疗。由于多胺本身性质很难被常规方法检测出来，本发明专利技术提供一种灵敏稳定的方法用于人体内血浆中多胺的检测，为癌症的临床诊断提供了依据，为抗癌药物研究开发提供了依据。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药
，具体涉及，更确切地说是一种对血浆中多胺类物质进行高效灵敏定量测定的方法。
技术介绍
多胺是一类小分子脂肪胺类化合物，带有两个或两个以上伯胺基与仲胺基，通常指1，3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺等。多胺在生物体内广泛存在，参与基因表达和翻译的调节、细胞增殖等生命活动过程，与癌症的发生发展密切相关。目前对体内内源性物质多胺的定量测定主要有液相色谱-荧光衍生化法、液相色谱-紫外衍生化法、免疫法和液相色谱-质谱检测法几种。液相色谱-荧光衍生化法具有灵敏的特点，但其它内源性物质易干扰其测定，专一性较差难以满足高水平临床研究的需要；液相色谱-紫外衍生化法具有专一的特点，但灵敏度又很难适合体内低浓度的多胺测定；免疫法虽操作相对简便，但对各多胺分离能力差，测定交叉干扰严重，且实施价格较高， 对临床后续研究性价值不高。液相色谱-质谱联用技术具有专一性强、灵敏度高的优点，在体内药物分析、内源性物质测定分析和代谢组学相关领域方面已有成熟的应用，是近年来应用迅速发展的分析测试技术。由于多胺是小分子化合物，具有结构简单、在体内含量低的特点，而临床检测需建立快速、灵敏、准确、经济的测定方法，因此实际能够应用在临床上的多胺检测方法目前尚未完全建立。
技术实现思路
本文目的是采用简便的预处理方法、灵敏的检测手段，建立血浆中多胺的分析方法，实现血浆中痕量多胺的检测，使多胺在癌症的预诊、治疗评价以及在抗癌药物的开发研究中发挥重要作用。本专利技术所述多胺类物质优选腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、精胺、精脒。本专利技术是这样实现的 (1)血样本预处理a.取一定量采集的血浆，加入一定量内标溶液及一定量高氯酸、酸性甲醇或三氯醋酸溶液，涡旋混勻后，高速离心取上清液；b.取经a步骤处理后的上清液，加入衍生化试剂、碱化试剂，涡旋混勻，在超声条件下反应后加入中止反应试剂、萃取溶剂后震荡，上层有机溶液转移吹干，加入甲醇超声离心后取上清液，进行LC -MS分析。(2)液相分离a.采用C18作固定相，b.流动相A甲醇，流动相B 水。梯度洗脱并控制流速3(3) MS测定 电喷雾离子源，正离子扫描。步骤(1) a操作中，内标溶液优选物质量浓度为500ng/ml的1，6_已二胺，高氯酸的质量浓度优选5%-9%，酸性甲醇的质量浓度优选1%_5%，三氯醋酸质量浓度优选5%-9%。步骤(l)b操作中，衍生化试剂、碱化试剂的加入顺序优选先加入碱化试剂，后加入衍生化试剂。步骤(l)b操作中，碱化试剂优选0.5 mol/L至2 mol/L氢氧化钠溶液，步骤(1) b操作中，衍生化试剂为苯甲酰氯溶液和乙腈的混合溶液，苯甲酰氯质量浓度优选1%_5%。步骤(1) b操作中，超声反应时的温度优选30°C。步骤(1) b操作中，中止反应试剂优选饱和氯化钠溶液。步骤(l)b操作中，萃取溶剂优选乙醚。步骤(2)中梯度洗脱优选14分钟内甲醇体积浓度由55 %上升到74 %，控制流速优选在0.8 ml/min-1. 2 ml/min，柱温优选20 °C_40。G，进样体积优选5 μ L-15 μ L0步骤(3)中，质谱条件优选毛细管电压=4200-4500 V，雾化气流速1. 1-1. 3 Bar, 干燥气流速5.0-7.0 L min—1，干燥气温度210-230 °C，扫描范围50-900 m/z，定量离子1,3-丙二胺 m/z: 303. 1，腐胺 m/z: 319. 1，尸胺 m/z: 333. 2，1，6-已二胺(内标)m/z: 347.2，精脒 m/z: 480.2，精胺 m/z: 641.3。本专利技术预处理方法操作简便，血浆杂质特别是其它内源性物质对多胺类物质定量检测无干扰；定量限不超过0.5 ng · mL-1。血浆中1，3-丙二胺、腐胺、尸胺、精脒、精胺在 0.4 200.0 ngmL-1浓度范围内线性关系良好，相关系数在0.9937、. 9972之间。低、中、 高三个浓度的质控样品日内、日间精密度(RSD)分别小于14 %和13 %，平均提取回收率在 77. 87 84. 0 %之间，基质效应在87. 0 103· 2 %之间，该方法灵敏、准确、重复性好。本专利技术方法所采用的衍生化试剂灵敏、活泼、可与各多胺发生定量完全反应，经与中止反应试剂反应后即可减少副反应发生，有利于多胺的体内定量分析。此衍生化试剂优于其它方法采用的苯磺酰氯、荧光胺类荧光衍生化试剂以及柱后衍生化试剂等。附图说明图1为采用实施例1方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6-己二胺、精脒、精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺(内标)，5为精脒，6为精胺。图2为采用实施例2方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6-己二胺、精脒、 精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺 (内标)，5为精脒，6为精胺。图3为采用实施例3方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6_己二胺、精脒、 精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺 (内标)，5为精脒，6为精胺。图4为采用实施例4方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6_己二胺、精脒、 精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺 (内标)，5为精脒，6为精胺。图5 采用实施例5方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6-己二胺、精脒、 精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺 (内标)，5为精脒，6为精胺。图6 采用实施例6方法测定血浆中腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、1，6_己二胺、精脒、 精胺的质谱总离子流色谱图，图中1为腐胺，2为1，3-丙二胺，3为尸胺，4为1，6-己二胺 (内标)，5为精脒，6为精胺。具体实施例方式实施例1(1)血样预处理a.取血浆样品250 μ L，加入质量浓度为5% HClO4 125 μ L，涡旋混勻，高速离心。b.取经a步骤处理后的上清液，加入2 mol mL1 NaOH 400 μ L，125 μ L苯甲酰氯质量浓度为4%的苯甲酰氯、乙腈的混合溶液，涡旋溶解混勻，30°C超声反应30 min,加入 1 mL饱和氯化钠溶液终止反应，以2 mL乙醚萃取衍生后多胺，空气流下吹干，以50 μ L甲醇超声复溶，15000 r. m. ρ离心3 min,取10 μ L上清液进行LC -MS分析。(2)液相分离色谱柱为Kromasil C18柱(250 mmX4. 6匪，5 μ m)；流动相A 甲醇，B 水；梯度洗脱0- 14 min 55 % A — 74 % A。流速为 1. 0 mL mirT1，柱温为 35°C， 进样10 μ L0(3) MS 测定质谱条件电喷雾离子源，正离子检测方式；毛细管电压4500 V，雾化气流速1.3 Bar，干燥气流速7.0 L min-1，干燥气温度230°C，扫描范围50-900 m/z，定量离子1,3-丙二胺 m/z: 303.1，腐胺 m/z: 319.1，尸胺 m/z: 333. 2，1，6-已二胺(内标) m/z: 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种血浆中多胺类物质的测定方法，包括(1)血样本预处理a.取一定量的血浆，加入一定量内标溶液及一定量高氯酸、酸性甲醇或三氯醋酸溶液，涡旋混勻后，高速离心取上清液；b.取血浆经a处理后的上清液，加入衍生化试剂，加入碱化试剂、溶剂等涡旋，超声反应后加入中止反应试剂、萃取溶剂后震荡，上层有机溶液转移吹干，加入甲醇超声离心后取上清液；(2)液相分离a.采用C18作固定相；b.流动相A水，流动相B 甲醇 (3)梯度洗脱并控制流速MS测定电喷雾离子源，正离子扫描。2.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于多胺类物质包括腐胺、1，3-丙二胺、尸胺、精胺、精脒等。3.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤(l)a操作中， 内标溶液为物质量浓度为500ng/ml的1，6-已二胺，高氯酸的质量浓度为5%_9%，酸性甲醇的质量浓度为1%_5%，三氯醋酸质量浓度为5%-9%。4.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤(l)b操作中， 衍生化试剂、碱化试剂的加入顺序为先加入碱化试剂，后加入衍生化试剂。5.根据权利要求1所述的血浆多胺类物质的测定方法，其特征在于步骤(l)b操作中， 碱化试剂为物质量浓度0. 5 mol/L至2 mol/L的氢氧化钠溶液。6....

【专利技术属性】
技术研发人员：李清，毕开顺，刘然，贾英，尹然，
申请(专利权)人：沈阳药科大学，
类型：发明
国别省市：