本发明专利技术公开了一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物。可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体，其序列如SEQ?ID?NO.1所示。所述的可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物T-VISA-BikDD脂质体，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示。本发明专利技术的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡，而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于医药生物领域，具体涉及一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞治疗载体及其药物。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，发病率逐年增高，严重危害了身体健康。乳腺癌手术治疗主要针对早中期乳腺癌，术后和晚期一般需综合治疗。化放疗不能杀灭乳腺癌干细胞，导致复发转移。综合治疗后，预后仍不满意，中晚期患者5年生存率仅10% -30%。三阴乳腺癌预后更差。乳腺癌干细胞是乳腺癌复发、转移和耐药的主要原因。因此，迫切需要探索高效靶向杀灭乳腺癌的新药物。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的T-VISA-BikDD治疗载体。本专利技术克隆端粒酶启动子hTERT，长度为418bp，具有肿瘤细胞特异性，但其活性在肿瘤细胞中不到CMV启动子活性的1 %，因此无法广泛应用，本专利技术首先将hTERT启动子控制fel4-VP2(两个拷贝的VP16，具有强烈的转录激活特性)融合蛋白基因；再将 Gal4-VP2融合蛋白与效应元件G5E4T结合，启动靶基因或目的基因的大量转录；然后将WPRE位于目的基因的3-UTR，增强mRNA稳定性的作用，由此构建得到hTERT_VP16_GAL4-WPRE (VP16-GAL4-WPRE Integrated Systemic Amplifier, VISA，整合性系统放大器)调控系统，简称为T-VISA(整合性系统放大器)系统，最后，结合BiKDD基因(突变的Bik自杀基因，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致细胞凋亡)作为治疗基因，建立T-VISA-BiKDD治疗载体，该T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。本专利技术的第二个目的是提供一种可高效高特异灭杀乳腺癌细胞的药物 T-VISA-BikDD脂质体，其特征在于，包括脂质体和被脂质体包被的T-VISA-BiKDD治疗载体，所述的T-VISA-BiKDD治疗载体的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的脂质体可以使用按照常规方法制备的脂质体，优选是通过以下方法制备的脂质体按照1摩尔胆固醇对应1. 7摩尔磷脂酰胆碱的比例，秤取磷脂酰胆碱与胆固醇，用磷脂酰胆碱质量1/4的氯仿作为溶剂溶解磷脂酰胆碱与胆固醇，将上述溶液置于旋转烧瓶中，旋转烧瓶使其混合均勻，再用真空抽吸器吸干溶剂，得到一层附着在烧瓶壁上的脂膜； 然后再用按8. 9/100ml/g磷脂酰胆碱的量加入质量分数为5%的葡萄糖溶液溶解已干燥的脂膜，旋转真空干燥，然后再加入双蒸水至上述质量分数为5 %的葡萄糖溶液的体积，在 50°C的超声水浴箱中进行超声处理lmin，再在50°C下收集通过0. 1 μ m的聚碳酸酯膜滤膜的脂质体。通过该方法制备的脂质体粒径为ISOnm左右，容许其穿透肿瘤细胞中极细的毛细血管并被细胞摄取。所述的药物T-VISA-BikDD脂质体优选通过以下方法制备的，将上述脂质体加3入到5%的葡萄糖溶液中使脂质体的浓度为8mM，将T-VISA-BiKDD治疗载体加入到5% 的葡萄糖溶液中使T-VISA-BiKDD治疗载体的浓度为lyg/y 1，然后将脂质体溶液和 T-VISA-BiKDD治疗载体溶液混合静置20min，由此得到药物T-VISA-BikDD脂质体。利用该方法制备得到的药物T-VISA-BikDD脂质体的粒径200 300nm，稳定性好，在4 8°C，1_2年无降解。本专利技术的药物T-VISA-BikDD脂质体在体外能高效杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系，而对正常细胞无杀灭作用，在动物模型中可抑制乳腺癌细胞的生长，延长小鼠的生存时间，对小鼠行为无明显影响，无死亡发生，无肝肾毒性。由此可见，本专利技术的T-VISA-BikDD治疗载体经脂质体包裹输送后，在乳腺癌部位富集，可高效靶向乳腺癌BCL-2靶点，与Bcl-2结合，释放Bad和Bax，导致乳腺癌细胞凋亡， 而对正常细胞无灭杀作用，可全身给药，基因表达量高、时间长、效率高，药效确切，毒副作用低，无肝肾毒性，在治疗乳腺癌的具有广阔的前景。附图说明图1是T-VISA-BikDD结构示意图，它是以pUK_21为基本骨架，kana抗性的可治疗性载体；图2是动态光散射测量实施例2制得的脂质体(Liposome)和实施例3的 T-VISA-BikDD 脂质体(Liposome+T-VISA-BikDD)的粒径及其分布；图3是T-VISA-BikDD脂质体在体外杀灭一般乳腺癌细胞、三阴乳腺癌细胞和乳腺癌干细胞细胞系的结果图，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照，T-VISA-BikDD表示 T-VISA-BikDD治疗载体的处理，Her-2，ER，EGFR分别是指人类表皮生长因子受体2，雌激素受体和表皮生长因子受体，-表示阴性，+、++、+++分别表示阳性，弱阳性和强阳性。士表示不确定。图4是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中抑制乳腺癌生长的示意图，其中Ctrl 表示没有做任何处理的空白对照；图5是T-VISA-BikDD脂质体在动物模型中的肝肾毒性，其中Ctrl表示没有做任何处理的空白对照。具体实施例方式以下是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。一、T-VISA-BikDD 脂质体的制备实施例1 :T-VISA_BikDD治疗载体的构建(一)pCRII-TOPO-hTERT 质粒克隆1、常规方法提取乳腺癌MCF-7细胞(从美国ATCC公司购买)的DNA。2、以该DNA作为模板，设计扩增hTERT的PCR引物，hTERT PCR上游(R)rward)和下游(Reverse)弓丨物Forward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' (XbaI)Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc age3、以乳腺癌 MCF-7 细胞 DNA 为模板，hTERT PCR 引物(i^orward :5' -ata tct aga ggc ccc tcc ctc ggg tta ccc cac agc_3' ；Reverse :5' -ata gat ctt atg egg ccg ccc acg tgc gca gca gga cgc age gc_3' )、Pfu DNA polymerase、dNTP 禾口 PCR 反应液， 扩增获得hTERT启动子(-416 to+Ι)产物，其序列如SEQ ID NO. 2所示。其PCR反应体系 10XPCR buffer5 μ 1，上游(Forward)和下游(Reverse)引物各 1μ 1，MCF_7 细胞 DNA 为模板 IOOng DN A, 25mM MgCl2 3 μ 1，IOmM dNTPs 1 μ 1，Pfu-Taq (IU/ μ 1)，最后补水至 50 μ 1。 PCR反应条件94°C热变性5min，94°C变性lmin，55°C退火lmin，72°C延伸2min，共进行30 次循环；最后72°C延伸IOmin。4、PCR产物用Qiangen公司(美国)PCR DNA回收试剂本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢小明，郭姣丽，谢新华，李来胜，孔亚楠，
申请(专利权)人：中山大学肿瘤防治中心，
类型：发明
国别省市：
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