提高黑曲霉木聚糖酶表达量的基因及其重组质粒和宿主细胞，涉及对来源于黑曲霉的木聚糖酶基因进行偏爱密码子的优化、GC含量调整、顺式作用元件及顺向重复序列优化。通过设计定点突变引物，对原始的黑曲霉木聚糖酶基因进行人工改造，获得在毕赤酵母超量表达的木聚糖酶基因xynBT。改造后的黑曲霉木聚糖酶基因xynBT在毕氏酵母中的表达量较原始基因xynB提高了2.6倍，在3L发酵罐中高密度发酵时，木聚糖酶基因xynBT在毕赤酵母中的表达水平达到20424.2U/mL。本发明专利技术可用于木聚糖酶基因的分子改造及其重组木聚糖酶的生产，能显著提高木聚糖酶的表达水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学以及基因工程等领域，尤其涉及一种改进的黑曲霉木聚糖酶基因及其重组质粒和重组质粒后的毕赤酵母细胞。
技术介绍
木聚糖是阔叶植物和禾本科植物细胞壁的主要成分之一，广泛存在于水果、谷物以及秸秆中。木聚糖酶的全称为β_1，4-木聚糖内切酶或1，4-β-木聚糖木糖水解酶(EC 3. 2. 1.8)，其功能是水解木聚糖主干链内部的1，4糖苷键产生低聚木糖或带有侧枝的寡聚糖(Curr Opin Biotechnol，1996，7(3) :337-342)。随着生物技术的发展，人们逐渐认识到木聚糖酶在造纸工业、生物化工，以及食品和饲料等工业中有着非常广阔的应用前景。在造纸过程中，沉积在纤维上的木聚糖是木质素抽提的主要障碍，木聚糖酶的应用能提高木质素的抽提率；用木聚糖酶处理草浆可显著改进草浆的滤水性，脆性等性能，提高纸浆白度和强度，使草浆可用于生产高质量的纸制品；同时，木聚糖酶的前处理可以降低漂白中的氯和含氯化合物的用量，从而减轻对环境的污染。生化产品低聚木糖是重要的食品或医药产品添加剂，目前广泛应用的制备方法是从玉米芯中提取木聚糖，再以木聚糖酶水解产生低聚糖。食品加工时，应用木聚糖酶水解面粉中的木聚糖使水在戊聚糖相和谷蛋白相重新分布，能够大大地改善面制品的质地、结构、松软度和保质期；果汁和啤酒中含有的多糖类物质影响了清纯度，木聚糖酶可以降解这些多糖使之澄清。木聚糖酶的使用还能改善农作物青贮饲料的营养成分，有利于动物的消化吸收(中国食品学报，2005，5(1) :1-8)。对于木聚糖酶及其基因的研究已经形成热点。但是，虽然已有上百种木聚糖酶被提纯或基因克隆，木聚糖酶的产量并不高；即使使用了基因工程菌，目前世界上能够提供木聚糖酶的生物公司仍然很少。同时，不同来源的木聚糖酶具有不同的性质。而真菌来源的木聚糖酶相对于细菌来源的木聚糖酶具有酶活力高和分子量较小的特点，更容易渗透进木质纤维原料，从而提高水解效率(Appl Microbiol Biotechnol，2005，64 1412-1419)。黑曲霉是木聚糖酶的生产菌株。但是，通过营养条件和培养条件的优化，黑曲霉的木聚糖酶活力仍不能满足工业上的需要，而且成本较高。研究表明，对木聚糖酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高木聚糖酶活力的最有效方法。研究表明，外源蛋白表达的差异，一方面是受到表达条件的影响，另一方面，由外源基因本身的特性决定。从现有的国内外研究现状来看，对外源基因表达的优化基本上集中在发酵条件的优化。主要包括(1)酵母菌的生长密度，培养温度和PH ； (2)甲醇诱导的浓度和诱导时间。 通过这些培养条件的优化，提高了外源目的蛋白的表达量。但实际上，要显著提高外源目的蛋白的表达量，其上游技术至关重要。其技术主要包括(1)基因内部结构的优化。外源基因在巴斯德毕赤酵母中能否表达或表达高低首先受到外源基因内部结构的影响，也是表达成功的前提和首要因素。其中，外源基因在宿主中表达时，同一种氨基酸可有1 6个密码子，但不同的宿主对编码同一氨基酸的密码子使用频率不同，有些密码子使用频率很高，有些几乎不使用，高效表达的基因倾向于使用部分特定的同义密码子，这些密码子即为改种生物高效表达基因的优越密码子。这就是密码子的偏爱性。目前，国内外都有学者对毕赤酵母部分密码子的用法进行了分析。以Arg为例，编码6种密码子在酵母高效表达基因、低效表达基因使用频率明显不同，密码子CGA和CGG使用频率为0，密码子CGC几乎不使用， 而AGA使用频率最高。研究表明，在酵母中表达较高的基因往往是采用酵母本身所偏爱的密码子；那些富含毕赤酵母稀有密码子的外源基因在毕赤酵母中很难得到高效表达。在不改变氨基酸组成的前提下，将编码外源蛋白的密码子优化为酵母的偏爱密码子，可以实现外源蛋白在酵母体内表达或表达量的显著提高。到目前为止，对黑曲霉木聚糖酶基因进行定向改造实现在毕赤酵母中的超量表达在国内外还未见研究报道。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术的目的是大幅度提高黑曲霉木聚糖酶基因表达水平，获得在毕赤酵母中超量表达的黑曲霉木聚糖酶基因xynBT，并进行高效表达。因此提供了一种改进的木聚糖基因及其重组质粒和重组质粒后的毕赤酵母细胞。技术方案提高黑曲霉木聚糖酶表达量的基因，核苷酸序列xynBT如SEQ ID NO. 1所述。包含上述SEQ ID NO. 1核苷酸序列的重组质粒。包含上述SEQ ID NO. 1核苷酸序列的重组质粒pPICZ α -xynBT。包含SEQ ID NO. 1所述黑曲霉木聚糖酶基因的重组质粒制备方法，步骤为(l)xynBT的合成设计一组28条寡核苷酸，所述28条寡核苷酸序列如SEQ ID NO. 2 SEQ ID N0.四所述；黑曲霉的木聚糖酶基因xynBT的获得采取两步PCR扩增技术，第一步，反应体系50yL，其中5yL的全部观条寡核苷酸引物100ηΜ，4μ dNTP Mixture (包括 dATP、dGTP、dCTP 和 dTTP)各 2. 5mM, 5 μ L 10XPCR Buffer, 2. 5U Ex Taq, 加水补足50 μ L，反应条件为94°C预变性5min, 94°C变性30s, 59°C退火30s, 72°C lmin, 30 个循环，72°C延伸lOmin;第二步，PCR扩增基因xynBT，反应体系50 μ L 包含第一步的反应产物 2yL，引物 SEQ ID N0. 2 :10μΜ IyL,引物 SEQ ID NO. 29 :10μΜ 1 μ L,4y L dNTP Mixture 各 2. 5mM，5XPCR Buffer 10μ L,2. 5U Ex Taq，加水补足 50 μ L，反应条件为94°C 预变性 5min, 94°C变性 30s, 59°C退火 30s, 72°C lmin, 30 个循环，72°C延伸 IOmin ；(2)重组质粒pPICZ α -xynBT的构建将获得的改造后的基因xynBT和pPICZ α -A 分别用内切酶EcoR I.Sac II进行分步酶切，并分别割胶回收，浓缩后16°C反应过夜，宿主菌使用ToplOF’的感受态细胞，涂布在LLB平板，LLB平板含25 μ g/mL Zeocin,倒置平板过夜，挑选单菌落到5mL液体LLB中，LLB中含25 μ g/mL Zeocin, 37°C，200rpm培养8h，得到重组质粒 pPICZ α -xynBT。含有上述重组质粒的毕赤酵母宿主细胞。具体方案内容为包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及高效表达。1.参照Genebank上已发表的黑曲霉木聚糖酶的基因序列(登录号为AF490982) 设计引物，以提取的黑曲霉的DNA为模板进行PCR，获得基因全序列，在通过去除内含子得到目的基因，并将基因克隆到PMD19-T载体，得到重组质粒pMD19-T-xynB(具体见实施例 1)。2.根据以下原则对黑曲霉木聚糖酶基因xynB序列进行定向改造1)选用在毕赤酵母中使用频率较高的密码子；2)由于毕赤酵母糖基化程度较低，xynB基因中的糖基化位点保持不变；3)为降低mRNA 二级结构的最小自由能(MFE)，在碱基编排过程中去除了富含本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：赵林果，李飞，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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