本发明专利技术公开了一种细胞角质蛋白19片段CYFRA21-1的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含CYFRA21-1磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，CYFRA21-1校准品、CYFRA21-1质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明专利技术还公开了该试剂盒的制备方法。本发明专利技术试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明专利技术试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及测定血清的试剂盒及其测试方法，尤其是涉及测定血清中细胞角质蛋白19片段(CYFRA21-1)含量的试剂盒及其测试方法。
技术介绍
细胞角蛋白19(CYK_19)是一分子量约40，OOODa的I类角蛋白(酸性蛋白)，是角蛋白家族中最小的成员。CYK-19广泛分布在正常组织表面，如层状或鳞状上皮中。在恶性上皮细胞中，激活的蛋白酶加速了细胞的降解，使得大量细胞角蛋白片段释放入血，其可溶性片段可与两株单克隆抗体KS19. 1和BM19. 21特异性结合，故称为CYFRA21-1。CYFRA21-1 分子量约30，000Da。在恶性肺癌组织中，CYFRA21-1含量丰富，尤其是在肺鳞癌中有高表达。CYFRA21-1对各型肺癌诊断的敏感性依次为鳞癌>腺癌>大细胞癌>小细胞癌。从检测角度上来说，目前临床上用于测定CYFRA21-1的方法主要有放免法、ELISA法、化学发光法等。过去以放免为代表的细胞角质蛋白19片段(CYFRA21-1)测定试剂盒受方法学的限制，其灵敏度和抗干扰能力严重不足，存在很大的弊端，已基本上退出市场，目前应用较多的为酶联免疫检测技术和化学发光技术。化学发光技术兴起于上个世纪80年代是继酶联免疫技术和放免技术之后发展起来的新兴技术，由于其高灵敏度、高特异性，同时方法简便、快速，标记结合物稳定，无放射性同位素损伤和污染等特点，在近些年得到了飞速发展。磁微粒分离酶联免疫检测技术是一种以磁性微粒为固相分离载体，将免疫磁微粒分离技术与酶联免疫检测技术相结合而建立的一种新型免疫检测方法。传统ELISA方法， 抗原、抗体的结合反应是在固相(ELISA板反应孔)表面进行的，而磁微粒分离酶联免疫检测方法，抗原、抗体的结合反应也在近似液相的条件下进行，因而反应快速、彻底。与传统 ELISA相比具有灵敏度高，检测用时少的优点。
技术实现思路
本专利技术需要解决的技术问题在于提供一种细胞角质蛋白19片段(CYFRA21-1)定量测定试剂盒及其检测方法，采用该试剂盒进行CYFRA21-1检测具有较高的灵敏度和特异性，和更短的获得检测结果的时间和更简便的操作方式。本专利技术提供了一种细胞角质蛋白19片段(CYFRA21-1)的定量测定试剂盒，其包含的试剂有CYFRA21-1磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，校准品、质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。所述的磁分离试剂含有标记有抗CYFRA21-1单克隆抗体的磁性微球。所述的酶反应物是含有碱性磷酸酶标记的抗CYFRA21-1单克隆抗体。所述的反应增强剂是含有Tris的缓冲液。所述稀释液是含有BSA溶液。所述的校准品及质控品是含有一定量的CYFRA21-1抗原的BSA蛋白溶液。所述清洗液浓缩液是含有TWEEN-20和ftx)Clin-300的缓冲液。所述的底物溶液为酶促化学发光底物溶液。本专利技术细胞角质蛋白19片段(CYFRA21-1)的定量测定试剂盒的制备方法，包括下述步骤第一步磁分离试剂的制备过程一、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制IL 1、称取 TRIS 4. 58g 和 NaC16. 81g 于 IL 容器中，称取 0. 96g TWEEN-20 于 20ml 容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述容器中；2、用移液器将ftOclin-300量取0. 2ml于IOml纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述IL容器中，然后在上述IL容器中加入800ml纯化水，充分搅拌；3、调节PH计测量其PH值，调PH，控制PH在7. 95-8. 05之间；4、称取BSA 3g倒入上述IL容器中；5、最后定容至1000ml，用0. 2um滤器过滤；过滤完后贴好标签于2_8°C冷库贮存。二、磁分离试剂的制备过程1、将1. Omg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50ul DMSO中，取2mg抗CYFRA21-1单克隆抗体溶于PH 9. 5的0. lmol/L PB缓冲液中至总体积为Iml ；2、确定辛二酸二琥珀酰亚胺酯的投入量，用移液枪吸取辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min ；3、将步骤2抗体溶液加入到Centricon-10浓缩管中然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下浓缩30min至体积为0. 5ml ；4、取0. 5ml磁珠，加入5ml反应杯中，放入专用试管架，经磁铁吸附2分钟后吸取上清；5、每次加入1. 5ml PH9. 5 0. lmol/L PB,混勻30秒，上架，去上清，重复操作3次； 将步骤4获得的抗体溶液加入到上述磁珠中，混勻后室温反应4小时；6、加入 0. 3ml lmol/L 的 TRIS 溶液 37V 15 分钟；7、每次加入1. 5ml PH 7. 2 0. lmol/L PB清洗已经标记的磁珠，混勻30秒，上架，去上清，重复操作3次；8、用IOOml磁珠保存液将磁珠转入125ml玻璃瓶，即为0. 05%的CYFRA21-1磁分离试剂；磁珠保存液配方为0. 1% BSA, 0. 05%吐温-20，0. 02% NaN3，20%乙醇，4°C保存。9、将步骤9获得的磁分离试剂用磁珠缓冲液按照1 1的比例混勻，即得本专利技术试剂盒中磁分离试剂。第二步酶反应物制备过程一、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制IL 1、取 Tris 6. 06g、NaCl 13. 0g、Zncl2 0. 05g、Proclin-300 0. 2ml 禾口 MgCl2 0. 05g 于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800ml纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；2、调 PH，控制 PH 在 7. 35-7. 45 范围内；3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；4、最后定容至1000ml，用0. 2um滤器过滤即得。二、碱性磷酸酶ALP与抗CYFRA21-1单克隆抗体的偶联1、取IOmgALP加入5ml生理盐水中，加入到浓缩管中，3000RPM离心20分钟，浓缩至1毫升；2、向步骤1获得浓缩液中加入0. 2ml的0. IM NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用ImM PH4. 4的醋酸钠缓冲液透析，4°C过夜，收集保留液；3、向步骤3获得保留液中加入0. 2M PH9. 5碳酸盐缓冲液，使PH升高到9. 0，然后立即加入2. 5mg抗CYFRA21-1单克隆抗体，室温避光轻轻搅拌2小时，再加入0. Iml的^ig/ ml NaBH4溶液，混勻，置4°C下2小时；4、将上述液装入透析袋中，对0. 15M PH7. 4PBS透析，4°C过夜，收集保留液；5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4°C 1小时，然后 3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20ml的 0. 15M PH7. 4 的 PBS 中；6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0. 15M PH7. 4的PB缓冲盐水透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10，OOOrpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为 1 100的比例添加IM皿8(12溶液，即得碱性磷酸酶(ALP)与CYFRA21-1单克隆抗体的偶联物，最后将收集到的碱性磷酸酶(ALP)与CYFRA21-1单克隆抗体的偶联物用上述酶反应物稀释液以1 1000本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：不公告发明人，
申请(专利权)人：内蒙古科慧生物科技有限责任公司，
类型：发明
国别省市：
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