一种微生物总基因组DNA的提取方法技术

本发明专利技术公开了一种微生物总基因组DNA的提取方法，向待提取样品中加入裂解液和溶菌酶，使细菌细胞充分破裂并释放DNA；将获得的粗提DNA经过酚/氯仿/异戊醇提取液抽提后得到经纯化的微生物总基因组DNA。本发明专利技术提取方法具有DNA释放量大、实验条件简易、成本低等有益效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于环境科学和生物技术科学领域，具体地涉及一种微生物总基因组DNA 的简易提取方法，该方法借助于生物技术手段，获取样品中微生物基因组。
技术介绍
环境样品由于其成分的复杂性在对其进行DNA提取时，想要得到量大，纯度又高的DNA是比较困难的。相对于环境水样中微生物DNA的提取，养殖池塘底泥中微生物DNA提取难度更大。一方面，养殖池塘底泥中微生物种类更为丰富，这就提高了在DNA提取过程中对裂解细胞壁的要求；另一方面，底泥中富含的悬浮物，腐殖质和硫化物等物质，都会影响到所提取到的DNA的纯度，进而影响后续的PCR等实验操作。所以，使环境样品中微生物细胞壁充分裂解释放DNA以及获得纯度较高的DNA样品是养殖池塘底泥微生物总基因组DNA 提取和对底泥微生物多样性分析的关键。本专利技术解决了养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取中存在的操作时间长，所提取的DNA量少而纯度低等问题，提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，具有DNA释放量大、实验条件简易、成本低等有益效果。
技术实现思路
本专利技术提出了一种微生物总基因组DNA的提取方法，包括以下步骤(1)将TENP洗液加入待提取样品中，再经过8000rpm，4°C，离心得到沉淀；(2)向所述沉淀加入裂解液和溶菌酶溶液，于37°C进行水浴后，充分涡旋震荡；(3)加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，依次于55°C、70°C下进行水浴，于17000g，4°C，离心得上清；(4)用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液对所述步骤(3)得到的上清进行抽提，经离心得上清，重复用等体积的酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提一次；(5)用等体积的氯仿/异戊醇抽提液抽提，离心得上清；(6)向所述步骤(5)得到的上清中加入异丙醇，室温下静置，离心得到DNA沉淀；(7)用乙醇将所述DNA沉淀重悬，离心后弃上清，经干燥得到沉淀；(8)用成分为IOmMTris-HCl, ImM EDTA, PH=8. 0的TE溶液将所述步骤(7)得到的沉淀溶解，得到所述微生物总基因组DNA，置于-20°C保存备用。当所述待提取样品是含有水分的，所述步骤(2)中进行水浴前还加入玻璃珠，并对待提取样品进行充分涡旋震荡处理。所述的步骤(1)中TENP洗液pH为8 10，添加量为1. 5^3mL,优选添加量为2mL。所述 TENP 洗液成分为 50 m mol/L Tris, 20 m mol/L EDTA，100 m mol/L NaCl, 0. 59Γ2. 5%w/v聚乙烯基吡咯烷酮。其中，聚乙烯基吡咯烷酮的优选添加量为l%w/v。所述的步骤(2)中，所述裂解液成分为IM Tris-HCl,0. 5M EDTA，0. 5M Na3P04,1. 5M NaCl, 1% CTAB ；所述溶菌酶溶液添加量为200 400 μ L，浓度为10_80mg/mL。3所述的步骤(3)中，SDS溶液浓度为20% 25%W/v，添加量为100 200 μ L ；蛋白酶K 浓度为15-30mg/mL，添加量为50 100μ L。所述的步骤(4)中酚/氯仿/异戊醇抽提液中酚、氯仿、异戊醇的体积比例为 25:24:1ο所述的步骤(5)中氯仿/异戊醇抽提液中氯仿、异戊醇的体积比例为对:1。所述的步骤(6)中所述异丙醇的加入体积是步骤(5)得到的上清体积的0. 6倍。所述的步骤(7)中所述乙醇为预冷的70%乙醇，添加量为广1. 5mL。本专利技术目的之一在于解决养殖池塘底泥微生物总基因组DNA提取过程中操作时间长，试剂价格昂贵以及提取到的DNA量少、纯度不够等问题。该方法可以很好的破裂革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的细胞壁，大量除去样品中的腐殖质和蛋白质，所得的DNA可以用于PCR-DGGE技术，能较准确地反映出底泥环境中细菌微生物的丰度和种群多样性。本专利技术将采集到的样品先用洗液洗涤，然后经过玻璃珠，裂解液和溶菌酶的作用， 使细菌细胞充分破裂，释放DNA。将获得的粗提DNA经过酚/氯仿/异戊醇抽提后得到纯化。按照本专利技术得到的DNA样品纯度较高，可直接用于后续的PCR等实验操作，且本专利技术操作简单，耗时短，一次可处理多个样品，非常适合在实验室条件下进行简单的DNA提取。针对养殖池塘底泥类样品中微生物总基因组DNA的提取，本专利技术具体操作步骤如下(1)把待提取样品放入离心管中，用洗液除去样品中的腐殖酸，SOOOrpm,4°C，离心后得到样品沉淀；(2)所得的沉淀中加入玻璃珠，裂解液和溶菌酶溶液，37°C水浴Ih后，充分涡旋，使细菌充分裂解释放DNA ；(3)离心管中加入SDS溶液和蛋白酶K溶液，使蛋白变性或降解，55°C水浴20min，7(TC 水浴 IOmin, 17000g, 4°C，离心 IOmin 得上清；(4)所得的上清转移至干净离心管中，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提液抽提两次，离心得上清；(5)上清转移至干净离心管中，用等体积氯仿/异戊醇抽提液抽提一次，离心得上清；(6)所得的上清中加异丙醇沉淀DNA，室温下静置一段时间，离心取沉淀；(7)所得的DNA沉淀用乙醇重悬，离心后弃上清，干燥沉淀；(8)所得的沉淀用TE溶液溶解，得到微生物总基因组DNA，并置于-20°C保存备用。上述步骤中洗液TENP的pH为10左右，可以有效地除去腐殖质。上述步骤⑵中溶菌酶的浓度为50mg/mL，添加量为300 μ L，涡旋时间为5 10min。上述步骤(3)中SDS浓度为25%w/v，添加量为100 μ L ；蛋白酶K的浓度为20mg/ mL，添加量为60 μ L。上述TE 溶液的成分为 10mmol/L Tris-Hcl，lmmol/L EDTA，溶液 pH=8。本专利技术上述方法也可适用于其他土壤中微生物DNA的提取，若待测样品是干燥的土壤，可以省去适用于含有水分的底泥类样品的玻璃珠，改为先用液氮研磨处理样品后，再按本专利技术其他步骤进行操作。本专利技术方法是利用物理、化学和酶等多种方法对细胞壁进行裂解，从而最大限度地释放DNA;另外，实验中所用的所有试剂和仪器都是基础的生物学实验用品，容易获得且价格低廉。使用本专利技术得到的DNA样品，可直接用于16 S rDNA片段的扩增，得到的DGGE 图谱能较准确地反映环境样品中细菌的丰度和多样性。附图说明图1养殖池塘底泥微生物基因组DNA电泳图谱。图2养殖池塘底泥微生物基因组DNA 16S rDNA扩增电泳图谱。图3养殖池塘底泥微生物基因组DNA PCR-DGGE电泳图谱。具体实施例方式结合以下具体实施例和附图，对本专利技术作进一步的详细说明，本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本专利技术中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施例上海市金山区漕泾养殖基地对虾养殖池塘底泥微生物DNA提取 1.底泥样品的前期处理1. 1取底泥样品0. 2g加入已灭菌的2mL TENP洗液(50 m mol/L Tris, 20 m mol/ L EDTA, 100 m mol/L NaCl，l%w/v 聚乙烯基吡咯烷酮，pH=10)，涡旋混勻，65°C水浴!3min， SOOOrpm离心5min，取沉淀。重复1步骤2 3次，直至上清变得较透明。2.底泥样品中微生物细胞壁裂解2.1向1. 1步本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王亭芳，常忠义，高红亮，赵云龙，金风杰，
申请(专利权)人：华东师范大学，
类型：发明
国别省市：