本发明专利技术属于DNA片段分析技术，具体地说是采用普通的Taq?DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP(Gold?525?dUTP)，可以对酶切后的BAC?DNA片段进行标记，然后用于ABI系列测序仪上进行DNA指纹片段分析的方法。所用主要试剂包括限制性内切酶、限制性内切酶缓冲液、Taq?DNA聚合酶、Taq?DNA聚合酶缓冲液、包含荧光染料Gold?525?dUTP的dNTP混合物。该方法可用于包括BAC?DNA指纹分析在内的所有DNA片段分析。其优点是灵敏度高、速度快、高通量而且成本低。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种用于BAC-DNA指纹分析的标记方法，具体地说是采用普通Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP (Gold 525dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA (细菌人工染色体DNA)片段进行标记，然后用于ABI系列的测序仪上进行DNA片段分析的方法。
技术介绍
DNA是地球上各种生物的遗传物质基础。限制性核酸内切酶可以切割DNA分子， 而且每一限制性核酸内切酶都有固定的切点序列。由于不同生物群体的DNA序列千差万别，因而用同一限制性内切酶消化后，所得DNA片段的长度分布也是千变万化的；同时DNA 分子中核苷酸排列顺序的变化有可能使该酶切位点丢失或增加，或者酶切片段的长度增加或减少。这种酶切片段长度分布的多样性就称为限制性片段长度多态性(Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP)，RFLP常用于生物群体的遗传分析。近年来，基于 RFLP的原理，发展了一系列的DNA片段分析技术，如聚合酶链反应/限制性片段长度多态性(PCR/RFLP)，扩增片段长度多态性(Amplification Fragment Length Polymorphism, AFLP)，限制性酶切指纹图谱(FingerprintMap)等，这些新技术使DNA片段多态性分析更为快速和完善，同时应用也越来越广泛。限制性酶切指纹图(Fingerprint Map)是指限制性酶切位点在DNA分子上的分布图，DNA分子上的酶切位点可以作为一种DNA标记定位的特征区域。基于限制性酶切指纹重叠群图谱(Fingerprint Contig Map)是将一套部分重叠的大片段基因组DNA分子(Yeast artificial chromosome YAC, Bacterial artificial chromosomeBAC克隆等的插入片段) 依其在染色体上的位置顺序排列，不间断地覆盖着染色体上一段完整的区域。重叠群图谱是目前最常见的物理图谱，因为重叠群就是克隆之间的相互重叠关系，这是物理图的基本框架，然后借助染色体特异性的分子标记可将重叠群定位在染色体上。目前构建重叠群物理图谱主要方法是用毛细管电泳法来分析BAC DNA(Bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体DNA)片段的大小，一般首先用3-4个6碱基识别位点的限制性内切酶酶切DNA以产生不同的3'粘性末端，然后用荧光染料标记；另外一个4碱基识别位点酶消化DNA后产生5'平末端，该酶主要用于增加酶切片断的数量。然后酶切产物连同分子内标在DNA分析仪上进行毛细管电泳，电泳过程中电脑自动捕获荧光信号得到DNA片段大小的信息，经编辑后用FPC软件进行重叠群的组装(Luo M. C.，Thomas C. , You F. Μ. , Hsiao J. , Ouyang S. , Buell R. , Malandro Μ. , McGuire P. Ε. , Anderson 0. D. ,and Dvorak J. ,2003,High-throughput fingerprinting of bacterial artificial chromosomes using theSNaPshot labeling kit and sizing of restriction fragments by capillary electrophoresis, Genomics, 82 (3) :378-389)。该方法具有序列分析胶的高分辨率，但又免去了序列分析胶法的放射自显影步骤，省去了目力识带及随之带来的误差， 因而具有高通量、自动化的特点。目前采用荧光标记BAC DNA片段制作限制性酶切指纹图的方法主要有两种1.采用SNaPSiot试剂盒，这是Applied Biosystems公司开发的一种试剂盒，它带有4种荧光染料标记的 ddNTP,分别是 R6G-ddATP(绿色)，TAMRA-ddCTP(黄色)，RllO-ddGTP(蓝色)，ROX-ddTTP(红色)；实验中用4个6碱基识别位点的限制性内切酶酶切DNA以产生 4种不同的3'粘性末端，然后在FS AmpliTaq DNA聚合酶的作下标记用4种荧光染料分别标记不同的粘性末端。该方法能得到较多的条带，结果较精确；但成本很高，每个样品的花费在3美元左右。2.采用单色标记法，即一种荧光染料标记每一个克隆的所有粘性末端，通常采用HEX-ddATP (绿色)或NED-ddATP (黄色)来标记。该方法较SNaPShot试剂盒法简单，同时可以在一个通道(毛细管)中检测2个样品，虽然检测到的条带较前者少，但结果同样精确甚至更好(Xu Z. Y.，van den Berg Μ. Α.，Scheuring C.，Covaleda L. , Lu H. , Santos F. Α. , UhmT. , LeeM. , Wu C. , Liu S. , and Zhang H. , 2005, Genome physical mapping fromlarge-insert clones by fingerprint analysis with capillary electrophoresis -.a robustphysical map of Penicillium chrysogenum, Nucleic Acids Research, 33 (5) :50-57)，并且成本较低每个样品大约在1美元左右。然而HEX-ddATP和 NED-ddATP非常昂贵并且没有商品出售，很难得到。
技术实现思路
本专利技术采用普通Taq DNA聚合酶和一种新的荧光分子标记的dUTP (Gold 525dUTP)，可以对酶切后的BAC DNA片段进行标记，然后用于Applied Biosystems公司的 ABI系列测序仪上进行DNA片段分析。它是采用单色标记法，但可以避免使用SNaPS1Ot试剂盒或HEX-ddATP，NED-ddATP等昂贵的荧光染料和FS AmpliTaq DNA聚合酶，得到更精确的结果同时降低了成本，每个样品大约4-5元人民币(0. 6-0. 7美元)。本专利技术的主要原理为(1)设计一组包括一个4碱基识别位点和3-4个6碱基识别位点的限制性内切酶的组合，酶切BAC DNA产生带有3'粘性末端的片段；(2)在Taq DNA 聚合酶的作用下，3'粘性末端被相应的dNTP补平，在此过程中Gold525dUTP (绿色)被结合到末端上，同时该DNA片段的也实现了荧光标记。(3)随后标记了荧光染料的片段被纯化，通过毛细管电泳检测得到该片段的限制性酶切指纹，实现片段分析。本专利技术涉及一种新的用于BAC DNA指纹分析的标记方法，其中的试剂包括如下 (1)-(3)(1)酶切混合液包含IX酶切缓冲液；lmg/ml BSA(牛血清白蛋白)；限制性内切酶每种IU ；超纯水。其中BSA和限制性内切酶使用NewEnglandBioLabs公司产品，酶切缓冲液使用所选的几种限制性内切酶在其中都具有100%活性的缓冲液(如使用Hindlll、XbaI, XhoI和 HeaIII本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：相建海，张晓军，郇聘，赵翠，李富花，王兵，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：
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