本发明专利技术提供了牛分枝杆菌PCR鉴别用5对引物及鉴别方法，5对引物分别针对分枝杆菌属细菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群(MTBC)Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的Rv1970，牛分枝杆菌pncA基因和RD1区基因进行扩增，生成特异扩增片段，核苷酸序列如SEQ?ID?No.1～5所示。本发明专利技术的鉴别方法是以样品总DNA为模板，利用上述5对引物分别进行PCR扩增，根据扩增条带的大小判定结果。本发明专利技术引物能特异性地鉴别出分枝杆菌属，MTBC，结核分枝杆菌，牛分枝杆菌及牛分枝杆菌BCG，检测方法灵敏度好，方法简便，操作简单，能实现牛分枝杆菌快速、大通量的检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物检测鉴别技术，具体地说涉及对牛分枝杆菌进行PCR鉴别用引物及使用该引物的PCR鉴别方法。
技术介绍
牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性传染病，该病可通过病畜或其产品传染给人类或其他动物。感染牛结核分枝杆菌的大多数牛不呈显性感染或仅到晚期才出现临床症状，故早期临床诊断不易获得准确结果。病原学检查是最确实的方法之一，病理学检查可以根据特征病变确诊，但必须在动物死亡或宰杀后进行且所需确诊周期长，需3-8周，所以常常不被实际工作所采用。由于牛奶、牛肉等食品与人类生活息息相关， 结核杆菌可侵犯人和动物的全身各器官，以肺结核最常见。因此及时确定病原菌，合理进行牛结核病的防控有利于保障公共卫生安全。结核分枝杆菌复合群(MTBC)包括结核分枝杆菌、非洲分枝杆菌I型和II型、牛分枝杆菌、卡介苗、田鼠分枝杆菌、caprae分枝杆菌以及canettii分枝杆菌。目前临床上鉴别牛结核杆菌的方法最广泛的是变态反应诊断，但该法存在着极强的非特异性反应，即在相当数量的结核变态反应阳性牛中，既找不出特征病变，又不能分离出结核杆菌，或仅仅分离出非典型的分枝杆菌，而且妊娠母牛仍然检出率低，在重复检疫时阳性率下降，因此在实际工作中用于诊断牛结核病并不十分理想。近年来，以聚合酶链式反应(PCR)和实时荧光PCR为代表的分子生物学技术在结核或副结核病原菌快速检测鉴别方面发展较快，但均为针对结核分枝杆菌复合群，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌单独菌种的方法，也有直接通过基因分型方法直接鉴别出分枝杆菌各种型的，然而这些方法有的只给出了鉴别单独菌株的引物，有的给出了很多信息，却没有进行灵敏度试验，这对于临床运用是不够完善的，有的不够经济，成本较高，如荧光定量PCR。 例如2002年Richard C. Huard等建立了鉴别分枝杆菌复合群中各菌株的PCR方法，能特异性的鉴别出MTBC中的各种菌；2007年张鹭等根据牛分枝杆菌MPB70的特异性基因序列进 PCR扩增，检测牛奶中的MTBC，阳性率达到40. 9%，灵敏度达到40ng/L ；2007年孟祥红等人建立了多重PCR技术可以快速鉴别结核分枝杆菌和非分结核分枝杆菌，应用多重PCR法与 BACTEC培养的结果有很高的一致性，为临床结核病和分枝杆菌病的鉴别诊断提供了有效的手段；2010年贾广乐等根据IS1081序列设计荧光定量PCR引物及探针，建立了牛结核病 TaqMan荧光定量PCR检测方法。上述方法，都只是单独的给出了鉴别某一种菌的PCR相关方法，有的采用探针杂交，荧光定量等经济成本较高的方法，这些都不利于临床检测样品， 目前还没有系统地使用整套引物对分枝杆菌属类的主要细菌进行鉴别的报道。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种鉴别牛分枝杆菌的PCR用引物及PCR鉴别方法。本专利技术用于PCR鉴别牛分枝杆菌的特异性引物组合，用于鉴别分枝杆菌属、结核分枝杆菌复合群、结核杆菌、牛分枝杆菌和牛分枝杆菌BCG株。其分别能对分枝杆菌的16SrRNA保守区、结核分枝杆菌复合群(MTBC)Rv0577基因，结核分枝杆菌RD7区域的 Rvl970,牛分枝杆菌pncA基因和RDl区基因进行扩增，生成特异性扩增片段。本专利技术提供的牛分枝杆菌PCR鉴别用引物组合，包括1 16SrRNA-F 5’ -ACGGTGGGTACTAGGTGTGGGTTTC-3，；16SrRNA-R 5’ -TCTGCGATTAGCGACTAAGACTTCA-3’ ；2MTBC-F 5’ -ATGCCCAAGAGAAGCGAATACAGGCAA-3’ ；MTBC-R 5’ -CTATTGCTGCGGTGCGGGCTTCAA-3’ ；3MT-F 5’ -GCGCAGCTGCCGGATGTCAAC-3’ ；MT-R 5’ -CGCCGGCAGCCTCACGAAATG-3 ‘；4PncA-F 5， -CTCAGCTGGTCATGTTCCCGAT-3，；PncA-R 5’ -CGGTGTGCCGGAGAAGCCG-3’ ；5RD1-F 5’ -AAGCGGTTGCCGCCGACCGACC-3’ ；RDl-R 5’ -GAGGCGATCTGGCGGTTTGGGG-3，。本专利技术提供一种牛分枝杆菌PCR鉴别方法，该方法以样品总DNA为模板，利用上述引物组合分别进行PCR扩增，反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。本专利技术提供一种鉴别牛分枝杆菌的PCR方法，还包括当待测菌为未知菌时，以样品总DNA为模板，利用权利要求2所述的第1 5对引物组合，分别进行PCR扩增；或当待测菌为分枝杆菌属细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第2 5对引物组合，分别进行PCR扩增；或当待测菌为结核分枝杆菌复合群细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第3 5 对引物组合，分别进行PCR扩增；或当待测菌为结核分枝杆菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第4 5对引物组合，分别进行PCR扩增；或当待测菌为牛分枝杆菌细菌时，以样品总DNA为模板，利用上述第5对引物，进行 PCR扩增；反应结束后根据琼脂糖凝胶电泳判定结果。含有16SrRNA、MTBC, PncA引物对的PCR的反应程序为预变性94°C、5min，再经 94°〇变性4()8，601退火40s，72°C延伸40s，31个循环，最后72°C延伸IOmin ；或含有MT引物对的PCR的反应程序为预变性94°C、5min，再经94°C变性40s，61°C 退火40s，72°C延伸40s，31个循环，最后72°C延伸IOmin ；或含有RDl引物对的PCR的反应程序为预变性94°C、5min，再经94°C变性40s，62°C 退火40s，72°C延伸40s，31个循环，最后72°C延伸IOmin。上述PCR扩增反应体系，其中20 μ 1反应液的具体配置为上游引物下游引物 Taq Mix ddH20250ηΜ 0.5μ1 250ηΜ 0.5μ1 10μ1 8 μ 5ng 0.5μ1DNA模板可以将本专利技术引物以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。本专利技术的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本专利技术的引物，根据需要该引物可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外， 本专利技术的试剂盒中还可以包括用于PCR反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本专利技术所需要的其它成分及用具。使用本专利技术的引物以及方法进行鉴别的样品来源包括分离的菌种资源或动物组织，但并不局限于此。本专利技术提供了上述5对引物在制备用于检测及鉴别牛分枝杆菌的试剂中的用途。应用本专利技术的PCR鉴别方法能鉴别出减毒的牛结核分枝杆菌，如BCG，而减毒牛结核分枝杆菌常常作为制备预防结核病的疫苗的种子来源，因此本专利技术还提供了上述5种引物或本专利技术的PCR鉴别分枝杆菌的方法在制备预防结核病疫苗中的应用。本专利技术提供的5对引物是经过筛选优化获得的，可以逐步缩小待检分枝杆菌所属范围，获得准确的相关检测结果，一旦在整套反应方向上某对引物出现阴性结果，就立即可以确定待检分枝杆菌所属范围，这是与分枝杆菌属、种群分类复杂性相关的。分枝杆菌属、 结核杆菌复合群MTBC、结核杆菌、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG株关系图见图17。通过使用本专利技术的5对本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周向梅，赵德明，李华，林敬钧，杨利峰，尹晓敏，杨春华，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：
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