本发明专利技术提供了一种新的Bt蛋白Cyt3Aa1及其编码基因，所述蛋白具有SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列，或SEQ?ID?No.2所示的氨基酸序列经取代、缺失和/或增加一个或多个氨基酸且具有同等活性的氨基酸序列。本发明专利技术提供的Bt蛋白Cyt3Aa1可以用于制备Bt杀虫剂，编码该蛋白的基因可以转化水生植物，使其具备相应的抗虫活性，从而降低化学杀虫药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种新的Bt蛋白及其编码基因和应用。
技术介绍
多年来，人类对蚊虫普遍采用化学防治手段进行防治，但由于化学农药的长期、大量使用，造成了对环境的污染，给人类的生存和健康带来了危害。此外，化学农药在杀灭害虫的同时，也杀伤了天敌及其它有益物，破坏了生态平衡。与化学防治相比，生物防治具有安全、有效、持久的特点，并且避免了化学防治带来的一系列问题。在生物杀虫剂中，苏云金芽孢杆菌是目前世界上用途最广、产量最大的一类微生物杀虫剂。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，它的分布极为广泛，在芽孢形成的同时可形成具有杀虫活性的由蛋白质组成的伴胞晶体，又名杀虫晶体蛋白Gnsectididal crystal proteins，简称ICPs)是由cry基因和cyt基因编码的。人们已经分离克隆了 470多种编码杀虫晶体蛋白的基因，根据编码的氨基酸序列同源性它们被分别确定为不同的群、亚群、类和亚类(Crickmore N.，et al. 1998. Microbiol Mol Biol Rev, 62 :807-813 ；http://www. biols. susx. ac. uk/Home/Neil_Crickmore/Bt/)。 Cyt蛋白最早是在对双翅目昆虫具有毒性的Bt以色列亚种中发现的，它是Bt在芽孢阶段产生的δ -内毒素组成。截止2010年12月，已发现的Cyt蛋白共有31种，根据氨基酸序列同源性可分Cytl和Cyt2两大类。Cyt蛋白对埃及伊蚊杀虫活性测定表明CytlAa、CytlAbl、 Cyt2Aal和Cyt2Bal都对伊蚊有活性，但是Cytl蛋白的活性高于Cyt2类^li Donglai, Li Yidan, Gao Jiguo. 2005. Journal of Northeast Agricultural University.12 (1) 5-10.)。自然界水体中广泛生长着可作为蚊幼虫食物的蓝藻。1996年，闫歌等将携带有 Bt杀虫晶体蛋白基因的pDa6穿梭质粒，通过接合转移导入多种鱼腥藻中进行表达。所得至丨J的基因工禾呈藻 Anabaena sp. 7120、A nabaena cylidrica 禾口 Anabaena subtropic 对淡色库蚊幼虫，24h半数致死浓度(LC50)分别为:3.51\104细胞/!^、3. 32 X IO4细胞/mL和 4. 34X IO4细胞/mL。工程藻在连续传代50余次的情况下，仍能对淡色库蚊幼虫有较高的毒杀作用；在不加抗菌素条件下，穿梭质粒稳定，杀蚊幼虫毒效水平与加抗菌素培养的工程藻相差不大，为持续控制蚊幼虫的研究提供了新的途径。由于Cyt蛋白与Cry蛋白具有不同的作用原理，Cyt蛋白对某些Cry蛋白具有增效作用，使其越来越受到关注。研究发现，Cyt蛋白对双翅目害虫的作用并不主要在于其毒力本身，而在于它能增强其它杀虫晶体蛋白的杀虫活性，例如=CytlAa蛋白与Bt以色列亚种其它Cry蛋白之间存在着明显的协同作用，将CytlAa与Bt以色列亚种其它杀虫蛋白按照不同比例进行混合，发现比单个蛋白的毒力提高了 4 10倍(Crickmore N, et al. 1995. FEMS Microbiol Lett, 131 :249-254)。苏云金芽胞杆菌在农作物和园艺植物害虫、森林害虫以及卫生害虫的防治方面得到广泛的应用，也起到良好的效果。但是频繁地使单一 Bt杀虫蛋白的必然结果是因害虫的适应而产生对Cry类蛋白的抗性；目前，许多昆虫种群己相继在不同程度上对杀虫晶体蛋白产生了抗性。上世纪80年中期开始，抗性问题不断在实验室及田间试验中得到证实(Mc Gaughey W. H.，1985. Science. 2 :193-195)，原因主要是持续使用单品种及亚致剂量的Bt以及Bt转基因抗虫植物的应用造成昆虫种群长期受到杀虫剂的选择压力。 上世纪90年代以来，在夏威夷首次证实大田中的小菜蛾对Bt杀虫剂产生了明显的抗性 (Tabashnik B. E.，et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 91 :4120-4124)；在我国应用 Bt 杀虫剂时间较长的深圳、广州、上海等地，发现Bt杀虫剂对小菜蛾防治效果明显下降，意味着抗性已经形成(冯夏.1996.广东小菜蛾对苏云金杆菌的抗性研究.昆虫学报，39(3) 238444)。目前，发现在实验室及田间至少有十几种昆虫对Bt及其杀虫晶体蛋白产生了抗性，用选择压力数学模型预测到，在Bt转基因抗虫植物选择压力的条件下，昆虫将会产生抗性(Schn印f E.，et al. 1998. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 65 (3) :775-806)。研究表明， Cyt蛋白能降低双翅目害虫对Cry蛋白的抗性=CytlA和CryllA混合能使五带淡色库蚊 (Culexquinquefasciatus)抗性系对 CryllA 的抗性降低 1000 倍，而 CytlA 与 Cry4、CryllA 混合使用则能完全抑制五带淡色库蚊抗性系对Cry4和CryllA的抗性。五带淡色库蚊经以色列亚种晶体蛋白(含有CytlAa蛋白)选择观代后，抗性仅提高3倍；但若所用为不含 CytlAa的晶体蛋白，则其抗性将提高90 900倍。以色列亚种从应用于杀蚊虫以来，至今尚未发现有明显的抗性发生，其中CytlAa蛋白起着关键作用。正是由于Cyt蛋白独特的抗蚊幼虫作用，以及其增强Cry蛋白毒力、降低或延缓 Cry蛋白抗性的特性，使得它将在Cry蛋白抗性的长期治理中充当重要角色，寻找新的cyt 基因资源对我国的生物防治有着十分重要的意义。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的在于提供一种新的Bt毒力蛋白Cyt3Aal。本专利技术的第二个目的在于提供编码所述蛋白的基因。本专利技术的第三个目的在于提供上述蛋白及基因的应用。本专利技术从四川省沐川原始森林地区土壤中分离得到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)新菌株TD516。该菌株已于2009年01月12日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCJia 北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所，邮编100101)保藏，分类命名为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，保藏号为 CGMCC No. 2859。通过对TD516的毒力测试表明，TD516对双翅目害虫具有极高的毒力。根据cyt3 类基因保守序列设计1对特异引物，扩增其基因组DNA，结果表明该菌株存在cyt3类基因， 进一步设计其全长基因引物，克隆得到cyt3Aal基因，其核苷酸序列如序列表SEQ ID No. 1 所示，全长为777bp，析表明，GC含量为32. 56%，编码258个氨基酸组成的蛋白。经测定， 其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。被国际Bt杀虫晶体蛋白基因命名委员会正式命名为 cyt3Aal0 Cyt3Aal蛋白的氨基酸组成如表1。该蛋白的活性中心位于O)区段。表1 Cyt3Aal蛋白的氨基酸组成权利要求1.一种B本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：朱军，李平，郑爱萍，王世全，唐裕杰，邓其明，李双成，王玲霞，刘怀年，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：
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