本发明专利技术公开了基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法，本发明专利技术首次测定了不同温度下配体的解离平衡常数KD值，根据不同温度下配体的解离平衡常数KD值首次测定了不同温度下配体结合的自由能变。本发明专利技术与目前最精确的药物功效预测技术相比，比如电生理技术(electrophysiology)，核磁共振技术(NuclearMagneticResonance)等，它能更准确的预测药物效能(efficacy)，因为它通过热动力学可以把药物对靶点的作用进行精确的量化。另外，本发明专利技术还具有高通量和微型实验性质的优点。因此，本发明专利技术将是靶向药物功效预测的趋势所在。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及靶向药物功效预测方法的
，具体的，涉及基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法。
技术介绍
1拟6年Perrin首次在研究论文中描述他所观察到的荧光偏振现象。以一束单一波长的偏振光照射溶液中的荧光物质，后者可吸收并释放出相应的偏振荧光。如果被激发的荧光物质处于静止状态，该物质仍将保持原有激发光的偏振性，如果其处于运动状态，该物质发出的偏振光将区别于原有激发光的偏振特性，也就是所谓荧光去偏振现象。近年来，以这种物理学现象为基础的技术正在生命科学研究的多个领域中扮演着越来越重要的角色。本申请人将荧光偏振现象结合现代物理中的热动力学应用于药学研究当中，专利技术了一套高通效的药物功效预测技术。1，4，5-三磷酸肌醇受体(IP3受体)是调节Ca2+释放的配体门控通道。该受体可以结合IP3后被激活。IP3受体是四聚体。每个亚单位包括2700个残基，每个亚基N末端 (NT, 1-604)附近具有1&结合中心(IBC，2M-604)，C-末端具有6个跨膜蛋白。最末端的一对跨膜区域，连同其四个亚单位的每个转弯环区，构成孔隙结构。当3 4个部位被IP3 占据时，IP3受体复合物构象发生改变，打开孔隙结构，储存的Ca2+随即释放。现有技术中，大部分研究者采用电生理技术(electro physiology)或者核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)来预测候选的IP3靶向药物的药效。电生理技术虽然精确度高，但是它操作十分复杂，且失败率非常高(98%)，因此对实验人员的技术和经验要求相当高。一位拥有10年以上经验的电生理博士后研究员，可能会花上2天的时间才能预测一种候选药物的功效。对于核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)，其耗费的时间起码在2天以上的时间。一个新药研发项目最初的候选药物通常超过10万个，经过初筛以后进入药学研究阶段的药物通常也超过1万个。因此，如果单一药物的预测时间都要几天的时间，那么对于上万种药物都进行精确预测所花费的时间和费用是非常高昂的。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法。该筛选方法可以把药物对细胞内信号传导通路的影响进行量化，比较精确的预测出药物的功效；基于荧光偏振技术操作简单的特点，结合现代机器人技术，还可以实现药物筛选的高通量，即能同时预测上百种药物的功效；大大缩减实验时间，节省药物研发费用。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案是基于荧光偏振分析的IP3受体靶标药物的筛选方法，步骤如下A.提供荧光标记配体、作为竞争配体的待测化合物、以及3种包含IP3结合结构域的受体多肽；分别为受体IBC、受体NT和受体V3!3K-NT ；所述受体IBC是位于IP3R受体2M-604位的IP3结合中心，所述受体NT是野生型的位于IP3R受体1-604位的IP3受体N末端片段， 所述受体V3!3K-NT是受体NT的33位氨基酸突变为赖氨酸的突变型IP3受体N末端片段；B.竞争结合分析实验将所述步骤A中的荧光标记配体、待测化合物、至少一种受体多肽置于容器内混合；C.通过荧光偏振技术测定所述步骤B的容器在不同温度下对应的荧光各向异性度A， 计算对应温度下待测化合物与相应受体多肽竞争结合时的平衡解离常数忍值，根据平衡解离常数忍值计算得到相应温度下的焓变ΔΗ，每种受体的焓变ΔΗ分别表示为ΔΗ ιβ。、ΔΗντ 禾口 Δ Hy33K ；D.计算ΔH IBC与Δ Hnt的差值，Δ H IBC与Δ Hnt的差值用Δ ( Δ H IBC _NT)表示，Δ ( Δ H IBC_NT)的绝对值越小，则待测化合物的药效越强；或者计算Δ Hv33k和Δ Hnt的差值，Δ Hv33k和 ΔHnt的差值用Δ (ΔΗν )表示，Δ (ΔΗν33Κ_ΝΤ)的绝对值越大，则待测化合物的药效越强。进一步的技术方案，所述荧光标记配体是将荧光素通过共价键连接到IP3制备的。进一步的技术方案，所述荧光标记配体是FITC_IP3。综上所述，本专利技术与现有技术相比，具有如下优点(1)本专利技术首次测定了不同温度下配体的解离平衡常数KD值，首次测定了不同温度下配体结合的自由能变。(2)本专利技术与目前最精确的药物功效预测技术相比，比如电生理技术(electro physiology)，核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)等，它能更准确的预测药物效能(efficacy)，因为它通过热动力学可以把药物对靶点的作用进行精确的量化。从热动力学的角度来说，药物与靶点结合是两种过程的推动结果，即熵(entropy，物质混乱的程度)，和焓(enthalpy，物质能量)。把热动力学与分子生物学结合起来，则我们可以根据药物与靶点结合的熵值和焓值来推测药物与靶点结合后对其造成了多大的改变，从而预测该药物对细胞内信号传导通路产生了多大的影响。更为重要的是，通过这一技术，我们可以把药物对细胞内信号传导通路的影响进行量化，比较精确的预测出药物的功效。通过对8种已知药物的实验，并与电生理技术对比，证明了荧光偏振技术对药物功效预测的准确性。(3)本专利技术的第二个特点是它的微型实验性质，本专利技术所需实验耗材的费用只有其它传统技术的一半。核磁共振技术需要大量高纯度的靶点蛋白，而电生理技术由于成功率非常低，也需要非常多的带有研究靶点的转基因细胞与其它实验试剂。而荧光偏振技术则不同，它对靶点蛋白的纯度与数量的需求相当小。通过应用现代机器人技术与高精度微量液体取样技术，本申请人实现了该技术的微型实验性质，大大降低了所需实验耗材，从而减小了新药研发的费用。(4)本专利技术的第三个特点是它的高通效，本专利技术技术能以较高的成功率同时预测上百种药物的功效。传统药理研究中预测药物功效的技术，如电生理技术(electro physiology)操作十分复杂，且失败率非常高(98%)，因此对实验人员的技术和经验要求相当高。一位拥有10年以上经验的电生理博士后研究员，可能会花上2天的时间才能预测一种候选药物的功效。对于核磁共振技术(Nuclear Magnetic Resonance)，其耗费的时间起码在2天以上的时间。一个新药研发项目最初的候选药物通常超过10万个，经过初筛以后进入药学研究阶段的药物通常也超过1万个。因此，如果单一药物的预测时间都要几天的时间，那么对于上万种药物都进行精确预测所花费的时间和费用是非常高昂的。基于荧光偏振技术操作简单的特点，本申请人通过结合现代机器人技术，实现了该技术的高通效性， 使该技术能同时预测上百种药物的功效。因此，本专利技术能大大缩减实验时间，节省研发费用。附图说明附图1为Δ ( AHibc _m)值与药效的关系图。附图2为Δ ( Δ Hv33mt)值与药效的关系图。具体实施例方式下面结合实施例及附图，对本专利技术作进一步的详细说明，但本专利技术的实施方式不仅限于此。实施例1 FITC-IP3的制备及纯化将以下反应设置在NMR样品管中反应，以便于通过核磁共振谱对反应过程进行监测。 包括如下步骤将20 ymol 2-氧-(2-氨乙基)-IP3溶解于0. 75 ml四氘代甲醇中，添加 50 μ 1三乙基胺，添加30 ymol F本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁兆，
申请(专利权)人：四川汇宇制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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