本发明专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种解脲脲原体PCR检测试剂盒。本发明专利技术目的是提供一种解脲脲原体PCR检测试剂盒及其检测方法，检测临床样品中解脲脲原体特有的核酸序列，从而达到快速判断解脲脲原体存在的目的。为实现上述目的，本发明专利技术的技术方案为提供一种解脲脲原体PCR检测试剂盒，包括DNA提取液、PCR反应液、dNTPs、tap酶、UNG酶、阳性对照、阴性对照、定量参比品，所述PCR反应液包括引物A和荧光探针A，所述引物分为上游引物A和下游引物A。本试剂盒具有灵敏度和特异性高、稳定、及时、操作方便等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物检测领域，具体涉及一种解脲脲原体菌株PCR检测试剂盒及其检测方法。
技术介绍
解脲脲原体⑴reaplasmaurealyticum简称UU)是人类泌尿生殖道常见的寄生菌之一，在特定环境下可致病。在人体的定植可有二次上升趋势，即分娩时由母体产道感染新生儿，以后迅速减少；从性生活开始又渐增多。近年来，解脲脲原体所致泌尿生殖道感染日益受到重视，是引起非淋菌性尿道炎的病原体之一。现已被列为性传播疾病的病原体。解脲脲原体是泌尿生殖道感染的常见病原体之一，一般为表面感染，大多不侵入血液。致病机制尚不十分清楚，目前认为可能与侵袭性酶和毒性产物有关。解脲脲原体在一定条件下能引起泌尿系统感染和不孕症。解脲脲原体多寄生在男性尿道、阴茎包皮和女性阴道。若上行感染，可引起男性前列腺炎或附睾炎、女性阴道炎、宫颈炎，并可感染胎儿导致流产、早产及低体重胎儿，也能引起新生儿呼吸道和中枢神经系的感染。常用几种检测方法MDI分析法作为一种活体检查的方法，MDI分析支原体的手段在业内一直倍受争议，该技术存在下列不足在泌尿生殖系统疾病中能检出的支原体高达7种之多，对支原体的类型鉴别存在困难；L-型细菌形态与支原体都缺乏细胞壁，两者在镜下难以分辨；国内尚无规范的实验方案，检测结果的标准化也有待完善，但该技术具备经济、直观和疾速的典型特征。我们的经验和研究证实，MDI分析能降低检查成本。缩短检查时间，且可以直接观察病原体，对检测UU有一定的应用价值，但仅适合于初筛。培养法是目前临床上发现传染源的主要途径和手段，是解脲脲原体诊断和治疗方案的重要依据，目前仍然以培养法为“金标准”。UU固体培养是公认的检测UU的金标准。 《全国临床检验操作规程》(第3版)对UU培养和药敏方法作了明确规定。由于固体培养对实验环境和操作人员要求较高，实验周期较长，同时药敏检测方法——琼脂稀释法比较繁琐，在一定程度上限制了其临床应用。免疫荧光检测这是最早使用的检测抗原的方法，通常是在固体培养的菌落上加入特异的荧光标记的一抗或二抗，在荧光显微镜下观察结果。但不易区分荧光染色的菌落和未染色的菌落；需要特殊的荧光显微镜，不易普及使用；免疫荧光抗体非特异性的反应会影响实验结果及实验结果保存时间短等缺点。免疫酶检测这种方法类似于菌落免疫荧光试验，只是用酶标抗体代替荧光标记抗体，操作步骤基本相同，普通显微镜下观察结果。但它需要的抗血清较多，染色过程中会冲掉菌落，抗原抗体反应影响因素复杂都制约了其应用。免疫结合检测这种方法是在免疫酶法的基础上发展而来的，其关键的一步是采用硝酸纤维素膜作为载体，利用该膜对蛋白质较好的吸附力，并与免疫酶方法相结合，完成对支原体表面抗原的测定。但免疫结合检测的敏感性不高，并且固定在NC膜上的支原体有时会减少特异的染色而加强了各支原体之间的交叉反应。
技术实现思路
本专利技术目的是采用聚合酶链式反应及分子信标荧光探针技术对解脲脲原体基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断解脲脲原体存在，对解脲脲原体感染的辅助诊断。本专利技术的技术方案为提供一种解脲脲原体PCR检测试剂盒，包括PCR反应液，其特征在于，所述PCR反应液包括引物和荧光探针，所述引物分为上游引物A和下游引物A 所述上游引物A的核苷酸序列为5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；所述下游引物A的核苷酸序列为5’ -GCTGCACTTACATCAGCTG-3’ ；所述荧光探针A的核苷酸序列为5，-TGCGGTTTACGAAATTGAAAACT-3，。优选的，所述试剂盒还包括DNA提取液、dNTPs、t ap酶、UNG酶、DNA聚合酶、阳性对照，阴性对照、定量参比品。优选的，所述dNIPs 包括 dATP、dCTP、dGTP、dCTP。优选的，引入了一个人工构建的内参照系统用于避免检测结果假阴性的内参照系统包括内参探针、引物和内参DNA，所述内参照系统为拟南芥内参照系统，所述内参照系统包括上游引物B:SEQ ID NO. 5、下游引物B :SEQ ID NO. 6、荧光探针SEQ ID NO. 7，具体如下上游引物B:5' -TCATCGTCGCTGGAGCTGGTT-3 ‘下游引物B 5 ‘ -CGGCGGTTTGTCAAGCTGAT-3 ‘荧光探针B:5' -HEX-CTTCTTATAGTCACTGCACTAAACTGGAT-TAMRA-3'。优选的，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记BHQ淬灭基团。本专利技术的另一种技术方案为提供一种解脲脲原体PCR检测方法，其中PCR扩增的靶序列为SEQ ID NO. 4，PCR扩增所用引物为上游引物序列如SEQ ID NO. 1，下游引物序列如=SEQ ID N0. 2，荧光探针序列如=SEQ ID N0. 3。作为上述方法的进一步设置，所述荧光探针A的5’端标记FAM荧光基团，3’端标记TAMRA淬灭基团。本专利技术的有益效果为利用解脲脲原体基因中高保守特异性核酸序列进行核酸扩增检测，从而判断解脲脲原体的存在。本试剂盒具有DNA提取效果好，操作简单、耗时短 O 3小时)，结果客观可靠，仪器自动收集和分析数据。灵敏度和特异性高。最低检出限为5.0X102COpieS/mL。使用了拟南芥内参照系统它在解脲脲原体基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保 PCR结果的可信性。附图说明图1 灵敏度参比品检测结果图；图2 标准曲线参比品检测结果图3:标准曲线；图4 :UU特异性结果图。具体实施例方式本专利技术采用聚合酶链式反应(PCR)及分子信标荧光探针(MoleculA. r beacon)技术对解脲脲原体⑴reaplasmaurealyticum简称UU)基因中高保守特异性核酸序列进行扩增检测，从而判断解脲脲原体的存在。从而指导临床医生对解脲脲原体感染的病人用药，帮助预后判断。上述高保守特异性核酸序列如SEQ ID NO. 4所示。内参照原理试剂盒设置了内参照基因，即拟南芥基因。它在解脲脲原体基因组和人类基因组中均无同源基因，因此可作为内参照以检测每次PCR反应中是否有PCR抑制物存在，从而确保PCR结果的可信性。当内参照结果为阳时，表示PCR反应体系以及操作正常； 因此当目的基因结果为阴时，内参照结果为阳就显得十分重要了 ；但当目的基因结果为阳时，内参照的扩增曲线较目的基因扩增曲线要推迟，或是内参照结果为阴都是正常的；然而目的基因和内参照基因结果都为阴时，该实验视为无效，需再重复。阳性对照原理每次试验都需同时做阳性对照。阳性对照结果为阳，表明对靶基因的检测系统是正常的；而当结果为阴时，表明该次实验无效，需重复。阴性对照原理为证明有否污染存在，每次试验也需同时做阴性对照。阴性对照结果为阴，表明本次试验无污染；如结果为阳，则表明该次实验无效，需重复。引物和探针本专利技术所应用的引物、探针均委托Sigma和Biosearch公司合成，并经Sigma质检合格(含质谱鉴定)；其中UU基因保守序列最优引物、探针序列组合如下所述上游引物A的核苷酸序列为SEQ ID NO. 1 5’ -GCTAAATCAACAGACGGT-3’ ；所述下游引物A的核苷酸序列为SEQ ID本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：何华东，姚雪，
申请(专利权)人：泰普生物科学中国有限公司，
类型：发明
国别省市：
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