在两液体间的薄固态界面上成像的方法技术

在此描述了一种用于光学显微工具的流体室，其具有固态膜，该固态膜具有第一侧和相对的第二侧；位于所述膜第一侧的第一流体腔，包括具有第一折射率的第一液体；以及位于所述膜第二侧的第二流体腔，包括具有第二折射率的第二液体，其中，第二折射率与第一折射率不同。在此还描述了把单个的生物分子成像的方法，该方法包括在具有不同折射率的第一液体和第二液体之间的固态膜处产生隐失照明场；以及探测位于所述固态膜处的单个的生物分子所连接的光学探测标记所发射的光。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是有关光学显微镜领域。更具体地，本专利技术利用两液体间的薄固态界面改进了生物分子的成像。
技术介绍
第一个参照人基因组序列的完成标志着一个时代的到来，基因体变异直接影响了药物发现和医疗。这个新的范式产生了对便宜和超快的DNA测序方法的急迫需求。在不久的将来，医疗从业者将能够在临床场合，在开处方之前常规地分析患者的DNA，并且与记载有和任何药品相关的基因信息的在线数据库进行核对。此外，负担得起的测序技术将改变比较基因组学和分子生物学的研究，允许科学家快速测序来自细胞变异体的整个基因组。 为了实现超快和便宜的DNA测序，需要新技术来代替基于Sanger双脱氧链终止协议的经典方法。这些新技术应该解决两个主要的瓶颈(1)样本尺寸应该被降到最低，使得可以从单个的DNA分子或少量的拷贝读出序列；以及(2)与当前的现有技术相比，读出速度应该提高几个数量级。固态表面，如氮化硅、氧化硅及其他，已经被很多生物医学应用所采用，包括组织工程、可植入装置以及基本研究。薄固态表面已经被用于不同的微米级和纳米级结构装置， 如生物传感和DNA测序应用中所采用的纳米缝隙和纳米孔阵列。最近有资料显示氮化硅膜适于作为衬底，以为例如生物分子探测和DNA测序这些应用产生固态纳米孔。涉及DNA易位的单分子光学探测的，以及通过固态纳米孔解链的固态装置已经被认为对生物传感和基因组测序非常关键。对于通过这些装置进行单分子的体外光学信号测量，采用显微镜的隐失模式非常有用。在生物医学研究和医疗装置领域，希望能够利用目标材料通过成像来研究分子、 细胞和组织。全内反射荧光显微镜(TIRFM或TIRF)就是一项这样的成像技术。固态材料已经被用于那些情况，然而它们与最新的光学显微方法不兼容，如TIRF。在现有的技术中， 很难把这些固态材料表面带入另一表面，如盖玻片的隐失场，并且构造把氮化硅膜和生物样本带入TIRF隐失场环境所要求的纳米流体通道非常繁琐。此外，由于微粒所固有的密度 (即使在干净的房间环境里)、在处理这些氮化硅晶圆的过程中所产生的颗粒物以及这些氮化硅膜芯片的温度约束限制，用氮化硅表面密封这些纳米孔非常困难。
技术实现思路
本专利技术的实施例通过横亘这些固态膜的两介质之间的折射率匹配的TIRFM(全内反射荧光显微镜)，在这些固态膜(携带纳米孔装置和其他生物样本)处实现了隐失模式激发。这使得可以获得膜上的一个或者更多生物分子的高分辨率、高对比度以及高感光度图像。根据本专利技术的一个方面，披露了光学显微工具的流体室，其包括具有第一侧和相对的第二侧的固态膜，位于膜第一侧的第一流体腔，该第一流体腔包括具有第一折射率的第一流体，以及位于膜第二侧的第二流体腔，该第二流体腔包括具有第二折射率的第二流体，其中，第一折射率高于第二折射率。固态膜可以是氮化硅、氧化硅、氧化铝、氧化钛或其他介电材料。固态膜可以包括沉积在硅晶圆上的氮化硅层。该氮化硅层可以是5 50nm厚。该硅晶圆可包括一窗口，所述氮化硅层覆盖或延伸跨越该窗口。第一液体可以是水性缓冲溶液或水。第二液体可以是细胞液、细胞膜或甘油。第一液体可以是浓缩的尿素溶液或CsCl溶液。可以在所述膜的第二侧提供连接到光学生物标记的生物分子。该生物分子可以是 DNA分子。该生物分子可以是RNA分子。该生物分子可以是蛋白分子。该光学生物标记可以是易激发的荧光团。第一液体腔可以是微通道。固态膜可以包括至少一个纳米孔，在一些实施方式中，其包括多个纳米孔。这些纳米孔可以排布成圆形或多边形阵列。根据本专利技术的又一方面，披露了用于把单个的DNA分子成像的光学显微工具，其包括流体室，该流体室包括覆盖硅晶圆的窗口的固态膜，位于该固态膜一侧的第一液体腔， 该第一液体腔内的具有第一折射率的第一液体，位于该固态膜另一侧的第二液体腔，该第二液体腔内的具有第二折射率的第二液体，其中，第二折射率低于第一折射率；盖玻片，流体室安置在盖玻片上，使得盖玻片形成所述第一液体腔的底面；物镜；物镜和盖玻片之间的浸镜油；光源，被设置成把光导向所述物镜，所述物镜被设置成把所述光聚焦，使得产生小于所述固态膜覆盖的窗口的隐失照明场；以及图像探测器，探测所述固态膜处的单个的 DNA分子发出的光。所述光源可以包括至少一个激励激光器，在一些实施方式中，包括多个产生不同波长激光束的激光器。所述图像探测器可以包括电子倍增电荷耦合器件(CCD)摄像机或光探测器。生物素-链霉亲和素化学法可被用于把单个的DNA分子固定在所述固态膜上。根据本专利技术的又一方面，披露了用于成像单个的生物分子的光学显微工具，其包括用于产生位于固态膜的隐失照明场的装置，该固态膜位于具有不同折射率的第一液体和第二液体之间；以及用于探测位于所述固态膜上的单个的生物分子所连接的光学标记发射出的光的装置。所述用于产生位于固态膜的隐失照明场的装置可以包括激励激光器和聚焦透镜。 所述用于探测由光学标记发射的光的装置可以包括光探测器或电子倍增CCD摄像机。所述光学显微工具还可以包括用于把所述单个的生物分子固定于所述固态膜的直ο所述隐失照明场可以小于所述固态膜的尺寸。根据本专利技术的又一方面，披露了成像单个的生物分子的方法，其包括在固态膜处产生隐失照明场，该固态膜位于具有不同折射率的第一液体和第二液体之间；以及探测位于所述固态膜的单个的生物分子所连接的光学标记发射的光。所述方法还包括把所述单个的生物分子固定于所述固态膜。从所述探测到的光产生图像。根据本专利技术的又一方面，披露了成像单个的DNA分子的方法，其包括把光导向光学显微工具的物镜；引导光穿过第一液体；在氮化硅膜处反射该光以在第二液体内产生隐失照明场；以及把所述隐失照明场激发的并连接至所述单个的DNA分子的光学标记所发射的光导向成像探测器。所述隐失照明场可以在所述第二液体内产生。所述单个的DNA分子可以被固定在所述第二液体内氮化硅膜上。附图说明图1是根据本专利技术一个实施例的流体室的示意图。图2是根据本专利技术一个实施例的流体室的界面的透视图。图3是根据本专利技术一个实施例的界面处TIR的示意图。图4是根据本专利技术一个实施例的光学显微工具的示意图。图5是根据本专利技术一个实施例的在TIRF下成像的单个的DNA分子的荧光图像。图6是根据本专利技术一个实施例的DNA测序方法的示意图。图7是根据本专利技术一个实施例的利用一比特(a)和两比特(b)DNA读出的同时进行电子光学探测的示意图。图8是根据本专利技术一个实施例的多色光学显微工具设置的示意图。图9是根据本专利技术一个实施例的孔定位计数的直方图。图IOA和IOB根据本专利技术的一个实施例展示了多孔探测中的额外步骤，包括从多个孔同时读出(图10A)和多个比特的同时读出(图10B)。图11是根据本专利技术一个实施例的流体室的示意图。图IlA是根据本专利技术一个实施例的图11所示的流体室的详细示意图。图IlB是根据本专利技术一个实施例的图11所示的界面的详细示意图。图12是根据本专利技术一个实施例的在TIRF下成像的单个的DNA分子的荧光图像。图13是根据本专利技术一个实施例的分析硬件的方块图。图14A C根据本专利技术一个实施例展示了电和光信号的同步。图15A 15B根据本专利技术一个实施例展示了 DNA分子穿过纳米孔的过程。图16A 16B展示了在如图15A 15B所示的穿过事件过程中，电和光信号的同止本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：G·V·索尼，A·梅勒，
申请(专利权)人：波士顿大学董事会，
类型：发明
国别省市：