提供了从生物样品分离RNA的方法，用于在生物样品中确定特定RNA剪接形式变体的存在的方法和手段，用于在生物样品中确定RNA比的相对比的方法和手段，和用于预测癌前子宫颈损伤的进展的方法和手段。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于在样品中检测RNA剪接形式的非靶向扩增方法对相关申请的交叉引用此遵照35U. S. C. § 111(a)提交的非临时专利申请，要求遵照35U. S. C. § 111(b) 于2009年5月1日提交的美国临时专利申请61/174，938号，以及遵照35U. S. C. § 111(b) 于2009年5月1日提交的美国临时专利申请61/174，946号由35U. S. C. 119(e) (1)规定的权益，其每一个均通过全文提述并入本文。
技术介绍
1.
本公开涉及用于在样品中确定核糖核酸(RNA)的存在的方法和试剂盒。2.相关技术描述特定核酸序列和序列改变的检测和表征已用于检测指示感染的病毒或细菌核酸序列的存在，与疾病和癌症相关的哺乳动物基因变体或等位基因的存在，和在法医样品中发现的核酸的来源的鉴定，以及亲子鉴定(paternity determination)。在正常生物过程中涉及的RNA种的表征对于理解多种鲜为人知的生物过程可能是重要的。检测RNA (例如，信使RNA，转移RNA，核糖体RNA，小核RNA和其他RNA)的检测和表征在许多领域包括分子生物学、毒理学和生物化学中是重要的工具。信使RNA(mRNA)是细胞必需的功能组分；在基因表达过程中，合成了 mRNA的功能性单链结构，其充当蛋白质合成中的翻译过程的中间模板。mRNA分子的短暂存在以DNA至RNA分子的转录起始，并最终结束于降解。在其生命期间，在翻译之前，mRNA分子可受加工、编辑和转运。剪接是用于修饰前 mRNA(pre-mRNA)以去除某些段称为内含子的非编码序列的过程；留下的段可包含蛋白质编码序列，并称为外显子。有时前mRNA讯息可以以几种不同方式剪接，允许单个转录物编码多个蛋白质。信使RNA(mRNA)的检测在诊断中是至关重要的，因为其可提供DNA检测无法提供的病毒载量和基因表达信息。这些因素常常给出关于疾病进展和预后的线索。mRNA检测的现有技术表现出多种问题，包括费用和污染的可能。反向杂交捕获(reverse hybrid capture)是用于RNA检测的新颖非靶向扩增技术，其可用于检测来自生物样品的特定基因转录物，具有非常低的污染风险。该方法使用与 RNA靶杂交的DNA探针。然后用杂交捕获抗体系统检测构建的杂交体。 最常见的mRNA检测方法包括Northern印迹，核糖核酸酶保护测定(RPA)，和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)。然而，这些技术的每一个，尽管在敏感度方面提供了一些优点，但需要对时间和材料的需求。此外，一些技术需要扩增靶mRNA，因为总mRNA仅代表总 RNA的约1 %，而任何具体mRNA占显著更小的百分比。表征目前，逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)广泛用于表征RNA转录物。然而该方法具有下述限制1)仅可共扩增有限数量的特定区；2)突变或选择性剪接(alternativesplicing)可限制特定 引物检测RNA的能力；和3)难以在连续模式方法中表征mRNA结构。简述本公开提供了 RNA检测的非靶向扩增方法，其能够表征RNA转录物。在一个实施方案中，本公开提供了 mRNA检测的非靶向扩增方法，其能够表征mRNA转录物。本公开提供了检测靶RNA存在的方法，该方法包括a)提供至少一种DNA捕获探针，其中所述至少一种DNA捕获探针结合于支持物；b)将靶RNA杂交至所述至少一种DNA捕获探针，得到靶RNA:DNA捕获探针复合物；c)分离所述靶RNA:DNA捕获探针复合物；d)提供至少一种DNA扩增探针，并将所述至少一种DNA扩增探针杂交至所述靶RNA:DNA捕获探针复合物，得到靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物；e)提供抗RNA:DNA杂交物抗体，并将所述靶RNA:DNA捕获/扩增探针复合物与所述抗体温育，得到靶RNA:DNA:抗体复合物；f)检测所述抗体，其中所述检测指示所述靶RNA的存在。在一个方面，抗体与可检测标记缀合，且检测步骤包括检测该标记。在一个方面，所述可检测标记选自下组碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶。在一个方面，检测步骤包括提供结合于所述抗RNA:DNA杂交物抗体的第二抗体，其中所述第二抗体与可检测标记缀合，且其中所述检测进一步包括检测该标记。在一个方面， 所述支持物包括磁珠。在一个方面，所述磁珠与至少一个链霉亲和素分子缀合，且所述至少一种DNA捕获探针与生物素分子缀合。靶RNA可来自病毒、细菌、分枝杆菌或疟原虫。靶RNA可来自疱疹病毒科 (Herpesviridae)，人免疫缺陷病毒，细菌噬菌体(bacteriophage)，衣原体属的种 (Chlamydia spp.)，奈瑟氏菌属的禾中(Neisseria spp.)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，分枝杆菌，SARS冠状病毒，正粘液病毒科(Orthomixoviridae)或乳头瘤病毒科 (Pap i11omav i r i dae)。在一个方面，所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针长度为约 15至约200个碱基。在一个方面，所述靶RNA为剪接变体，且选择所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针以检测所述剪接变体的存在。在一个方面，所述至少一种DNA捕获探针和所述至少一种DNA扩增探针与来自HPV 高风险型 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、26、66、73 和 82 的 RNA 互补。本公开提供了用于检测靶RNA的试剂盒，该试剂盒包含a)至少一种DNA捕获探针，结合于磁性支持物；b)至少一种DNA扩增探针；c)抗RNA:DNA杂交物抗体；和d)检测试剂。在一个方面，所述抗RNA:DNA杂交物抗体与可检测标记缀合，且所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。在一个方面，所述试剂盒进一步包含与所述抗RNA:DNA杂交物抗体结合的第二抗体，其中所述第二抗体与可检测标记缀合，且其中所述检测试剂包含所述可检测标记的底物。本公开提供了提供用于检测的靶RNA的方法，该方法包括将含有靶RNA的生物样品与羧基珠温育；分离珠；裂解附于该分离的珠的生物样品，并从裂解的生物样品分离珠， 其中所得的上清含有用于检测的靶RNA。附图简述为了进一步理解本公开的特性，目标和优点，应参照下述详细描述，并与下述附图一同阅读，其中类似的参照号代表类似的元件。附图说明图1是由生物素化的DNA探针(白色条形)捕获的靶RNA (带交叉线阴影的条形) 的概略图。“B”代表生物素模块(moiety) ；“SA”代表链霉亲和素模块；“AP”代表缀合于抗体的碱性磷酸酶，但SA可为任何其他适当的可检测模块(例如，辣根过氧化物酶等)。图2为描述使用DNA捕获探针(白色条形)，多种DNA扩增探针(黑色条形)，和多种DNA:RNA杂交物抗体以“扩增”信号而无需扩增靶RNA(带交叉线阴影的条形)的概略图。“B”代表生物素模块；“SA”代表链霉亲和素模块，B和SA可由其他其中DNA探针缀合于珠的缀合技术替代；“AP”代表缀合于抗体的碱性磷酸酶，但AP可为任何其他适当的可检测模块(例如，辣根过氧化物酶等)。图3是通过结合于底物⑶的不同DNA捕获探针捕获的靶RNA (虚本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：B洛，A福尔布莱特，I纳扎伦科，
申请(专利权)人：奇亚根盖瑟斯堡股份有限公司，
类型：发明
国别省市：
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