一种提高植物中纤维生物质能源利用效率的方法技术

本发明专利技术公开了一种提高植物中纤维生物质能源利用效率的方法。本发明专利技术提供了一种培育转基因植物的方法。本发明专利技术所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中咖啡酰CoA?3-O-甲基转移酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁组分变化和糖化效率提高的转基因植物；所述细胞壁组分变化体现为：酸不溶木质素含量降低、酸溶木质素含量降低和纤维素含量增加；所述糖化效率提高体现为：纤维素的酶解效率提高。本发明专利技术通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得CCoAOMT基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的总木质素含量降低6-10％，其中酸溶木质素含量明显降低，且葡萄糖的释放量显著增加。转基因导致的酸溶木质素含量下降对生物燃料的生产具有重要意义。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中。
技术介绍
快速增长的能源需求、化石资源的不断减少、环境污染加剧和全球性的气候变暖， 使得能源、资源与环境成为人类社会可持续发展所面临的重要问题，发展可再生且环境友好的能源代替化石资源已成为世界各国的共识，也是人类克服能源与环境危机，保障可持续发展的重要途径之一。生物质能是可再生能源的重要组成部分。生物质能的高效开发利用，对解决能源、 生态环境问题将起到十分积极的作用。植物通过光合作用固定二氧化碳和太阳能，全球每年植物生长所积累的生物质总能量相当于4527万亿千焦，除自然消耗外，净积累总能量为 2289万亿千焦，是2001年全球能源消费G19万亿千焦)的五倍以上。而在植物所积累的太阳能中，90%以上是以纤维生物质的形式存在。其中，纤维素约占45%，半纤维素约占 30 %和木质素约占25 %，通常称为木质纤维素生物质。所以，木质纤维生物质是地球上最丰富的可再生能源。利用木质纤维生物质材料生产乙醇已成为第二代生物基液体燃料研究的热点。目前已经市场化的生物燃料主要包括以粮食为加工原料的第一代生物乙醇和以植物油为加工原料的生物柴油，这两种生物燃料的发展都遭遇了生产原料不足的瓶颈问题。与之相比，第二代生物燃料纤维素乙醇的发展因原材料充足，显示出巨大的产业应用潜力。因此，我国《能源发展“十一五”规划》、《可再生能源中长期发展规划》等一系列政策法规中明确提出“积极发展以纤维素生物质为原料的生物液体燃料技术”。同时以法规的形式禁止玉米等粮食作物在生物乙醇生产中的应用。木质纤维素生物质制取燃料乙醇，是部分替代汽油和石油燃料的重要途径之一。 其中在燃料乙醇行业中起作用的主要是纤维素和半纤维素，木质素作为一种副产物，必须采取有效的预处理工艺进行脱除；目前由于五碳糖的发酵相对困难，燃料乙醇行业中利用的主要是纤维素。预处理后通过酸水解或酶水解等方法把木质纤维素生物质中纤维素和半纤维素分解成可用于乙醇发酵的葡萄糖或戊糖，这个过程称为“糖化”。经预处理和糖化过程获得的单糖，可直接用于微生物发酵，生产生物乙醇。总的来说，木质纤维素生产燃料乙醇包括预处理、糖化和发酵三个工艺过程。从目前的情况看，生物质燃料乙醇产业化过程中存在的主要问题是预处理成本高、糖化产率低。据估计，预处理占生物乙醇生产总成本的三分之一，名列三个工艺之首。预处理的作用是打开植物细胞壁复杂的结构，除去木质素，同时把目前还无法有效发酵的半纤维素溶解成单糖和寡聚糖而除去，降低纤维素的晶体构象，增加生物材料的空隙度，使糖化过程中纤维素酶更容易进入细胞壁内部发挥水解作用，提高生物质中纤维素的消化性和消化效率，最终提高糖化效率。糖化的方法主要有酸法和酶法。其中酶法由于对设备要求低、反应条件温和、产物特异，污染小而更具产业应用前景。与预处理和糖化工艺相比，发酵是比较成熟的工艺，尤其是六碳糖(主要是葡萄糖)的发酵。由于木质纤维素细胞壁组成和结构的复杂性，目前以木质纤维素为原料生产乙醇还存在成本高、操作困难等问题。尽管国内外在原料预处理、酶解、发酵等基础研究方面取得了长足进步，但在关键转化技术方面还存在很多问题，特别是缺乏经济有效的预处理方法、糖化效率低等问题，制约着纤维素燃料乙醇在产业上的广泛推广应用。因此，通过生物技术和基因工程等定向育种技术手段改变植物纤维生物质(即植物细胞壁)的结构和组成，提供可高效转化的生物质原材料，降低预处理的必要性，提高糖化效率，是促进纤维生物质原料制备生物乙醇实现工业化和商业化的重要途径。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。本专利技术所提供的培育转基因植物的方法，是降低目的植物中咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶编码基因的表达，得到与所述目的植物相比，细胞壁组分变化和糖化效率提高的转基因植物；所述细胞壁组分变化体现为酸不溶木质素含量降低、酸溶木质素含量降低和纤维素含量增加；所述糖化效率提高体现为纤维素的酶解效率提高。所述咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。所述咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶的编码基因为如下1)-3)中任一所述的基因 1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因；3)与1)或2)的基因具有90%以上的同源性且编码序列表中序列2所示氨基酸序列组成的蛋白的基因。所述降低目的植物中咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶编码基因的表达是通过将咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶编码基因的反义基因导入目的植物中实现的。所述咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶编码基因的反义基因的核苷酸序列与序列表中序列1所示的核苷酸序列反向互补。所述降低目的植物中咖啡酰CoA 3-0-甲基转移酶编码基因的表达是通过将重组表达载体pASCCoAOMTl导入目的植物中实现的；所述重组表达载体pASCCoAOMTl是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和 MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体PBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从^CbaI至 SalI的方向插入所述中间重组载体的)(bal和Mil位点间，得到的重组载体pASCCoAOMTl。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0本专利技术的另一个目的是提供一种重组表达载体。本专利技术所提供的重组表达载体，是通过包括如下步骤的方法制备得到的(1)在⑶S基因片段的5'端引入BamHI和SpeI酶切位点和3'端引入^icI和MlI酶切位点，得到⑶S'基因片段；将所述⑶S'基因片段插入载体pBI121的BamHI和 SacI位点间，替换载体PBI121上的⑶S基因，得到中间重组载体；(2)将与序列表中序列1所示的核苷酸序列反向互补的DNA序列沿着从^CbaI至 SalI的方向插入所述中间重组载体的^CbaI和MlI位点间，即得到的所述重组表达载体。所述的重组表达载体在使植物细胞壁组分变化和糖化效率提高中的应用也属于本专利技术的保护范围；所述细胞壁组分变化体现为酸不溶木质素含量降低、酸溶木质素含量降低和纤维素含量增加；所述糖化效率提高体现为纤维素的酶解效率提高。所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述双子叶植物具体为毛白杨(Populus tomentosa)0本专利技术通过转基因技术和反义RNA技术结合，获得CCoAOMT基因表达受到抑制的转基因杨树，转基因杨树成熟木材的总木质素含量降低6-10%，其中酸溶木质素和酸不溶木质素含量明显降低，且葡萄糖的释放量显著增加，酶解后葡萄糖的释放量与纤维生物质中的酸溶木质素含量呈明显负相关。转基因导致的酸溶木质素含量降低对生物燃料的生产具有重要意义。木质素改变，特别是酸溶木质素含量下降，能够显著提高转基因毛白杨的糖化效率，提高了木质纤维能源植物的生物燃料生产效率。附图说明图1为毛白杨茎干次生木质部的总RNA快速电泳示意图。。图2为CCoAOMT特异性本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王宏芝，魏建华，李云伏，李瑞芬，陈亚娟，张中保，张杰伟，
申请(专利权)人：北京市农林科学院，
类型：发明
国别省市：