本发明专利技术公开了一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法及应用，其步骤是：先通过PCR获得间隔序列，引入限制性内切酶识别位点；将该间隔序列连入突变了Eam1105I位点的pSP124载体，分别构建前T载体；引入ble基因作为筛选基因；通过酶切，电泳分离，切胶回收获得T载体，将微藻启动子片段连入Eam1105I酶切位点；微藻启动子连入后可得到完整的表达盒，由启动子、表达基因和终止子所组成。一种可克隆微藻启动子的T载体在检测微藻启动子功能中的应用，该方法简单，技术成熟可靠。利用该载体快速克隆微藻启动子，并在莱茵衣藻中进行启动子功能的验证，成为微藻基因工程研究人员的有利工具。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微藻基因工程领域，更具体涉及一种微藻启动子克隆T载体的构建方法，同时还涉及一种微藻启动子克隆T载体的用途，可用于微藻启动子的直接克隆并在莱茵衣藻中分析该启动子的功能，该方法可快速克隆微藻启动子并进行功能分析。
技术介绍
启动子是基因调控中普遍存在的顺式作用元件，是RNA聚合酶能够识别并与之结合而起始基因转录的一段DNA序列，通常位于基因5'端上游。它能决定转录的方向和效率，以及RNA聚合酶类型，并引导RNA聚合酶与模板的正确结合。因此，启动子的功能序列对于基因的表达调控机制的研究具有十分重要的意义。研究启动子功能的手段之一就是通过基因工程手段。它是分子生物实验的基本技术之一，即将一段需要克隆的外源DNA片段插入到载体DNA分子中形成重组DNA分子，然后将该重组载体转运到宿主细胞中，随着宿主细胞的繁殖载体进行复制，在这一系列过程中与载体相连的外源基因片段同时被克隆。传统的克隆方法是限制性酶切目的片段后再连接到载体的相应位点上，该方法存在效率低、 耗时长等缺点。于是研究人员又开发出了 T载体，它是一种很方便的克隆载体，因其末端带有突出的T碱基，可直接与Taq酶扩增产物末端突出A碱基配对，大大提高了 PCR产物与载体的连接效率。它是一种方便、高效的克隆载体，进行大量的克隆工作时，现实、简便的做法是使用商业化的T载体，常用的T载体包括pMD-18T、pGEM-T和pCF_T等。常见的T载体制备包括首先是通过酶切得到平末端，然后在末端连入T碱基，此方法需要消耗大量的载体和酶，成本高，耗时长。通过分子生物学操作在载体两段引入Eamll05I等限制性内切酶位点，通过酶切直接获得T载体，此方法更高效、简便。藻类是含有光合色素，营自养生活，没有根茎叶分化的低等孢子植物类群，对藻类基因启动子的研究是从1990年代初对聚球藻的研究开始的。它的研究相对高等植物落后很多，水稻、烟草和拟南芥等高等植物的启动子已经做了很多的研究，它们已经建立了稳定的遗传转化体系，可以购买到各种克隆载体、转化载体、报告蛋白和抗体等，其他高等植物的启动子也可以在拟南芥、烟草等模式生物中进行功能研究。然而，藻类基因表达调控的研究就相对较少，主要集中于藻类光合作用与固氮作用相关基因的启动子，真核微藻主要集中在小球藻和莱茵衣藻上。微藻的调控机制与高等植物差别很大，因此研究人员无法利用烟草、拟南芥等成熟的模式生物对其启动子功能进行研究。这大大妨碍了微藻的相关研究， 尤其是某些重要基因的调控机理研究。其他如雨生红球藻、硅藻和拟微绿球藻等经济微藻由于研究历史较短，目前还没有成熟的载体和表达系统对其启动子功能进行研究，因此，微藻启动子功能研究存在的主要问题有以下几方面(1)目前还没有商业化的微藻克隆载体、表达载体或报告载体，大大阻碍了研究工作的开展；(2)许多微藻包括雨生红球藻等还没能建立遗传转化体系，不能通过基因工程手段对其功能基因进行研究，也不可能对其启动子的调控功能进行研究；3莱茵衣藻是目前研究最多、技术最成熟的微藻，它是单细胞、带鞭毛的真核生物， 隶属于绿藻门，团藻目，衣藻属.衣藻的结构简单，原生质膜紧贴着细胞壁，顶端长有两根鞭毛，侧面具有一个眼点，多数细胞还有一个或多个液泡，一个占细胞总体积近40%的大型杯状叶绿体。衣藻因其培养条件简单；生长周期短；生长迅速；光合效率高而具有“光合酵母”之称.其生物学特性为在短时间内获得大量遗传稳定的转基因后代，并进行遗传学分析提供了便利条件。它也是少数三套基因组均能进行遗传转化的植物之一。长期以来，莱茵衣藻由于其自身的特点，一直被用作遗传研究的材料。广泛用于研究鞭毛结构和鞭毛组装，趋光性和生理节律，配子发生和交配和光合作用原理，叶绿体发育的分子生物学过程等，这些研究加深了我们对衣藻生理功能和遗传学的认识。它还有一个很大的优势，它作为微藻的模式生物进行了全基因组测序，这些研究和基因组数据使得衣藻的遗传学背景很清晰。所以，莱茵衣藻非常适合作为研究微藻的模式生物，包括功基因功能的研究，还可以用于研究微藻启动子的调控机理。
技术实现思路
本专利技术的目的是在于提供了一种微藻启动子的T载体的制备方法，该方法通过简单的PCR等分子生物学操作就可构建T载体，对操作人员要求不高，本专利技术详细提供了各步操作以及引物，技术成熟可靠，操作人员遵循该法即可得到T载体。可以利用该载体快速克隆微藻启动子，并在莱茵衣藻中进行启动子功能的验证，成为微藻基因工程研究人员的有利工具。本专利技术的另一个目的是在于提供了一种可检测微藻启动子功能的T载体的应用。 莱茵衣藻的研究方法和生化背景非常成熟，来源于其他微藻的启动子可以转化到莱茵衣藻中进行功能验证，解决目前微藻启动子功能难研究的困境，通过核酸杂交、PCR、蛋白质杂交等常规实验方法就可以完成，方便微藻研究人员所应用。为了实现上述的目的，本专利技术采用以下技术措施启动子的PCR产物可直接克隆进该载体并导入莱茵衣藻中进行功能分析。根据不同实验目的构建了两种τ克隆载体--pB-0. 45T载体和pRB-0. 45T载体，确保应用者能将微藻启动子导入莱茵衣藻中表达筛选基因，并以此作为分析其功能的依据。该专利技术将大大方便研究人员对微藻启动子进行研究，在微藻基因工程领域中发挥重要作用。一种可克隆微藻启动子的T载体的制备方法，其步骤是A、可克隆微藻启动子的前T载体的构建(1)以 pBlel/pBle2(pBlel :5 ‘ -GTAGATATCATGGCCAGGTG-3 ‘ , pBle2 5' -GCGGGTACCTTAATTAAGCTTC-3‘)为引物，通过PCR从质粒pSP124(为本实验室保存， 购自美国藻种库)中扩增出大小为970bp的ble-3' RBCS2终止子(94°C 3min ；94°C lmin, 58°C lmin，72°C lmin，25 个循环；72°C 1 Omin)，克隆进pMD 18_T (TaKaRa 公司)载体中，获得 Τ-ρ 124质粒，并经测序确认。通过EcoR V +Kpn I双酶切质粒Τ-plM获得ble_3' RBCS2 终止子，将它插入PSPlM载体的EcoR V +Kpn I位点，最后获得pBIM载体。(2)pB载体的构建通过Eamll05 I单酶切pBIM载体，获得线性载体，再经 T4DNAPolymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eaml 105 I位点。通过T4连接酶连接载体，获得PB载体。(3)pRB载体的构建通过Eamll05 I单酶切pSPlM载体，获得线性载体，再经 T4DNAPolymerase使载体末端平滑化，突变原有的Eaml 105 I位点。通过T4连接酶连接载体，获得PRB载体。(4)间隔序列的获得以 pB-bkt9/pB-bktlO (pB_bkt9 :5 ‘ -TTGGATCCGACTTTAC GTCCAGTTCCGTGACATTGA-3 ‘ ， pB-bktlO 5 ‘ -CAAGATATCGACGCTTCGTCTCGTCTAGCTGTGCTAT G-3')为引物，通过PCR从质粒091127-a3(为本实验室保存，由雨生红球藻基因组文库筛选得到)中扩增出大小为450bp的产物，获得引入两个Eamll05 I位点、EcoR 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王潮岗，胡章立，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：
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