本发明专利技术涉及具有高特异性的巢式PCR。本发明专利技术提供扩增目的序列1的方法，该方法可高效扩增单链目的序列，以及可显著抑制非特异性扩增。本发明专利技术的一实施方式中，在巢式PCR的第2阶段，混合与外侧正向引物(4of)互补、且不会为所述DNA聚合酶引发的DNA延伸反应提供起点的外侧正向封闭核酸(4ofb)。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及具有高特异性的巢式PCR。
技术介绍
图1所示的巢式聚合酶链反应(Nested Polymerase Chain Reaction,以下称之为 “巢式PCR”)，为扩增由第1单链DNA6及第2单链DNA7构成的双链DNA中所含的双链目的序列的代表性方法。以下，参照图1对巢式PCR进行简单说明。第1单链DNA6由3 ‘末端-第1非扩增序列6a_第2非扩增序列6b_单链目的序列Ia-第3非扩增序列6c-第4非扩增序列6d-5 ’末端构成。第2单链DNA7由5 ‘末端-第5非扩增序列7a-第6非扩增序列7b-互补单链目的序列Ib-第7非扩增序列7c_第 8非扩增序列7d-3'末端构成。第5非扩增序列7a、第6非扩增序列7b、互补单链目的序列lb、第7非扩增序列 7c、及第8非扩增序列7d分别与第1非扩增序列6a、第2非扩增序列6b、单链目的序列la、 第3非扩增序列6c、及第4非扩增序列6d互补。双链目的序列由单链目的序列Ia和互补性单链目的序列Ib构成。首先，混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、双链DNA (6/7)、外侧正向引物 Gof)、及外侧反向引物(5or)来调制第1混合液。外侧正向引物(4of)由具有5 40碱基的核酸构成，且与第2非扩增序列6b中所含3'末端的序列部分互补。外侧反向引物(5or)由具有5 40碱基的核酸构成，且与第7非扩增序列7c中所含3'末端的序列部分互补。因此，外侧正向引物(4of)及外侧反向引物(5or)分别结合在第2非扩增序列6b中所含3'末端的序列部分及第7非扩增序列 7c中所含3'末端的序列部分。其次，将该第1混合液在94°C 100°C加热1秒至100秒。随后，在50 70°C冷却1秒至100秒。并且，在70°C 80°C加热1秒至600秒。将这些步骤循环反复，扩增中间双链DNA。中间双链DNA为由中间单链目的序列6m及互补性中间单链目的序列7m构成的双链DNA。中间单链目的序列及互补性中间单链目的序列分别由3'末端-第2非扩增序列 6b-单链目的序列Ia-第3非扩增序列6c-5'末端、及5'末端-第6非扩增序列7b_互补性单链目的序列Ib-第7非扩增序列7c-3'末端构成。将至此为止的过程称为“第1阶段的PCR”。随后，进行第2阶段的PCR。混合扩增的中间双链DNA、DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、内侧正向引物 Gif)、及内侧反向引物(5ir)来调制第2混合液。内侧正向引物Gif)由具有5 40碱基的核酸构成，且与单链目的序列(Ia)中所含3'末端的序列部分互补。内侧反向引物(5ir)由具有5 40碱基的核酸构成，且与互补性单链目的序列Ib中所含3'末端的序列部分互补。因此，内侧正向引物Gif)及内侧反向引物(5ir)分别结合在单链目的序列Ia中所含3'末端的序列部分及互补性单链目的序列Ib中所含3'末端的序列部分。最后，将该第2混合液在94°C 100°C加热1秒至100秒。随后，在50 70°C冷却1秒至100秒。其次，在70°C 80°C加热1秒至600秒。将这些步骤循环反复，扩增上述双链目的序列。专利文献1及非专利文献1-3为与本专利技术相关的文献。专利文献1 国际公开W096/17932号公报非专利文献1 :Genome Research, 4, 376-379 (1995)非专利文献2 :Genome Research, 2,60-65 (1992)非专利文献3 =Phytopathology, 86，493-497 (1996)在第1阶段的PCR之后，且在进行第2阶段的PCR之前，需要去除外侧引物 4of/5or0其缘由在于，如果第2混合液中含有外侧引物4of/5or，如图2所示，在第2阶段的PCR中也会由外侧引物导致DNA的延伸反应。S卩，如图2所示，在第2阶段的PCR之后，不仅得到所期望的目的双链DNA，还会得到不期望且不需要的扩增产物。该不期望且不需要的扩增产物可导致目的双链DNA扩增效率的显著降低、电泳解析DNA的难度加大、以及基因诊断的失误。
技术实现思路
本专利技术的目的为提供一种利用巢式PCR有效扩增目的序列⑴的方法，本专利技术的方法可抑制上述不期望且不需要的扩增产物的产生。为解决上述课题，本专利技术提供以下所列的技术方案。(方案1)一种扩增由第1单链DNA (6)及第2单链DNA (7)构成的双链DNA中的双链目的序列(1)的方法，其中，所述双链目的序列(1)由单链目的序列(Ia)及互补性单链目的序列(Ib)构成，所述第1单链DNA(6)由3'末端-第1非扩增序列(6a)-第2非扩增序列(6b)-所述单链目的序列(Ia)-第3非扩增序列(6c)_第4非扩增序列(6d)-5'末端构成，所述第2单链DNA(7)由5'末端-第5非扩增序列(7a)-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(Ib)-第7非扩增序列(7c)_第8非扩增序列(7d)-3'末端构成，所述互补性单链目的序列(Ib)、所述第5非扩增序列(7a)、第6非扩增序列(7b)、 第7非扩增序列(7c)、及第8非扩增序列(7d)分别与所述单链目的序列(Ia)、所述第1非扩增序列(6a)、所述第2非扩增序列(6b)、所述第3非扩增序列(6c)及所述第4非扩增序列(6d)互补；所述方法包括以下的工序㈧及工序⑶混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述双链DNA(6/7)、及外侧正向引物 Gof)、及外侧反向引物(5or)，利用聚合酶链反应扩增中间双链DNA的工序(A)，其中，所述中间双链DNA由中间目的序列及互补性中间目的序列构成，所述中间目的序列由3'末端-第2非扩增序列(6b)_所述单链目的序列(Ia)-第 3非扩增序列(6c)-5'末端构成，所述互补性中间目的序列由5 ‘末端-第6非扩增序列(7b)-所述互补性单链目的序列(Ib)-第7非扩增序列(7c)-3'末端构成，所述外侧正向引物(4of)与所述第2非扩增序列(6b)中所含3'末端侧的序列部分互补，所述外侧反向引物(5or)与所述第7非扩增序列中所含3'末端侧的序列部分互补；以及混合DNA聚合酶、脱氧核糖核苷三磷酸、所述中间双链DNA、内侧正向引物(4if)、 内侧反向引物(5ir)、及外侧正向封闭核酸(4ofb)，利用聚合酶链反应来特异性扩增所述目的序列(1)的工序(B)，其中，所述内侧正向引物Gif)与所述单链目的序列(Ia)中所含3'末端侧的序列部分互补，所述内侧反向引物(5ir)与所述互补性单链目的序列(Ib)中所含3'末端侧的序列部分互补，所述外侧正向封闭核酸(4ofb)与所述外侧正向引物(4of)互补，且不能成为所述 DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。(方案2)方案1中记载的方法，其中，在所述工序(B)中还混合有外侧反向封闭核酸(5orb)，所述外侧反向封闭核酸(5orb)与所述外侧反向引物(5or)互补，且不能成为所述 DNA聚合酶引发的DNA延伸反应的起点。(方案3)方案1中记载的方法，其中，所述外侧正向封闭核酸(4ofb)，由位于3'末端的核苷酸中所含糖的3位OH基被氢、磷酸基、氨基、生物素基、巯基、或它们的衍生物置换或修饰的DNA构成。(方案4)方案1中记载的方法，其中，所述本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：夜久英信，林美穂，
申请(专利权)人：松下电器产业株式会社，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。