巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法，该基因的核苷酸序列cypI如SEQIDNO.1所述。通过对大肠杆菌表达载体的选择和基因的定向改造，选择的pTrc99A载体使重组蛋白的表达量大为增加，比选用的pET20b载体的重组蛋白表达量增加了3.8倍，酶活达到770U/mL。将改造后的编码巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因cypI插入pTrc99A，并转化大肠杆菌，其在大肠杆菌中表达的酶活较原始基因cyp提高了32%，酶活达到1020U/mL（图-2）。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种编码巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建方法，以及克隆、定点突变及其高效表达纯化方法。具体涉及对原始巨大芽孢杆菌的细胞色素P450酶基因进行生物信息学分析和基因的定向改造，以及重组酶的制备。
技术介绍
细胞色素P450 (cytochrome P450或CYP)为一类亚铁血红素一硫醇盐蛋白的超家族，它参与内源性物质和包括药物、环境化合物在内的外源性物质的代谢。细胞色素 P450酶分布广泛，至今已在各种动物、植物、真菌和细菌中都发现有其存在。(Estabrook R W, 1996, FASEB J, 10:202-204)细胞色素P450酶基因多样性决定了其结构多样性和功能多样性。细胞色素P450酶的功能不仅降解化合物以获得碳源，而且还解毒外源化合物以及合成具生物学活性的化合物如甾醇、前列腺素和花生四烯酸酯代谢物。细胞色素P450酶也被用于基因治疗以补偿重要代谢途径缺损。另外，细胞色素P450酶可被用于使立体和位置选择性的化合物加单氧化作用以产生重要的生物活性(冷欣夫等，细胞色素P450酶系的结构功能与应用前景，2001)。 细胞色素P450酶有如此多样的功能作用，体现出其生物学的重要性，可以预见细胞色素 P450酶的应用具有广阔的前景。通过调控其表达和活性，可望改变生物体内物质的代谢途径，改变产物的性质和数量。随着现代生物技术如基因工程技术的发展，人们可以操纵细胞色素P450酶基因的结构及其表达过程，由此改变细胞色素P450酶的活性，甚至构建具有天然细胞色素P450酶不具备的新活性。在细菌细胞色素P450酶中，P450-BM3又称CYP102A1，能催化中长链脂肪酸的末端羟基化，它能够快速催化链长大约C12-C20的饱和或不饱和脂肪酸的单加氧酶活性(Urlacher V B, Appl Microbiol Biotechnol 64(2004) :317-325)0 巨大芽孢杆菌 {Bacillus megaterium)是细胞色素P450酶的高产菌株，其中巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产生的细胞色素P450酶具有对不饱和脂肪酸超强的氧化催化能力(Hilker et al., 2007, Progress in Lipid Research 47(2008) : 1_14)。但是，通过营养条件和培养条件的优化， 巨大芽孢杆菌ALA2菌株所产的细胞色素P450酶不能满足工业上的需要，而且成本较高。 研究表明，对细胞色素P450酶的基因进行克隆、改造和重组表达被认为可以从根本上显著提高细胞色素P450酶性质的最有效方法(Daniel A et al. , Biotechnology J, 88(2001)167-171)。到目前为止，在GenBank和DDJB数据库中虽然已有其他巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因序列被报道，国内外也有实现了细胞色素P450酶基因在大肠杆菌中表达的研究报道，但均未进行该基因的超量表达的研究。大肠杆菌是目前应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。其遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济倍受遗传工程专家的重视。研究表明，外源蛋白在大肠杆菌中表达的差异主要由表达系统的选择及外源基因本身的特性决定。到目前为止，对巨大芽孢杆菌ALA2菌株细胞色素P450酶基因进行定向改造以及该重组酶的高效表达在国内外还未见研究报道。
技术实现思路
解决的技术问题本专利技术的目的是提供巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因及其重组质粒的构建及酶的纯化方法，本专利技术大幅度提高了巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶的重组表达水平，获得能在大肠杆菌中超量表达的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶基因cypl及其重组质粒，及其重组酶的纯化方法。技术方案编码巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶基因，该基因的核苷酸序列 cypl 拟 SEQ ID NO. 1 所述。包含上述核苷酸序列的重组质粒。 包含上述核苷酸序列的重组质粒pTrC99A-c_F/7/。包含上述核苷酸序列的重组质粒pTrC99A-Cj^/的制备方法，构建步骤为将获得的基因cyp和pTrc99A用内切酶Nco I和BamH I酶切，连接构建重组质粒pTrc99A-c_F/7， 通过一步反向PCR对第269位苏氨酸进行定点随机突变，经磷酸化后连接，获得重组质粒含有上述重组质粒pTrc99A-cj^/的宿主细胞为大肠杆菌T0P10。巨大芽孢杆菌ALA2细胞色素P450酶的纯化方法，挑取含重组质粒pTrc99A-cj^/ 的大肠杆菌摇菌培养；当培养至0D_达到0.6-0. 8，用终浓度0.5 mM IPTG诱导6_8 h ；离心收集菌体并洗涤；用镍柱纯化向洗涤后的菌体中加入IXBinding Buffer重悬菌体，超声破碎菌液后离心，然后取离心液上样，再用IXBinding Buffer洗柱子除去未结合的蛋白质，最后用含有80 mM咪唑的洗脱液洗脱，即得目标蛋白。具体方案内容为包括原始基因的克隆、基因的分析和定向改造以及重组酶的制备。1.参照Genebank上已发表的巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因序列(登录号为Genbank: J04832. 1)设计引物，以提取的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的基因组DNA为模板进行PCR，获得目的基因，并将基因克隆到PMD-19T载体，得到重组载体pMD19T-cj^，再以克隆得到的重组载体为模板，通过PCR扩增获得的基因克隆到大肠杆菌表达载体pET-20b和 pTrc99A，得到重组质粒pET20b-c_F/7和pTrc99A_c双，转化大肠杆菌诱导表达后酶活分别达到 200 U/mL禾口 770 U/mL (具体见实施例1)。2.通过对巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶蛋白的氨基酸序列进行比对分析，找到其活性中心位点，根据活性中心的序列设计一组用于新基因合成的寡核苷酸，运用DNA合成仪经过化学合成获得这组寡核苷酸引物，用反向PCR法获得全新的巨大芽孢杆菌细胞色素P450酶基因cypl (具体见实施例2)。3.重组质粒pTrc99A-cj^/转化大肠杆菌T0P10，加入IPTG诱导后，重组细胞色素 P450酶的活力达到1020 U/mL。为进一步提高制备细胞色素P450酶的效率，本研究优化了纯化方法，最终得到电泳纯的重组细胞色素P450酶(具体见实施例3)。有益效果通过对大肠杆菌表达载体的选择和基因的定向改造，同时结合选择的 pTrc99A使重组蛋白的表达量大为增加，是选用的pET20b的重组蛋白表达量增加了 3. 8倍， 酶活达到770 U/mL。改造后的巨大芽孢杆菌ALA2菌株的细胞色素P450酶基因cypl在大肠杆菌中的酶活较原始基因cyp提高了 32%，酶活达到1020 U/mL (图-2)。附图说明图1 为重组质粒 pPTrc99A-c_F/7/ ；图2为重组大肠杆菌表达细胞色素P450酶的蛋白电泳图。(a)不同表达载体的全细胞蛋白样品表达水平。M为蛋白质Marker ；第1泳道为重组大肠杆菌(含pTrc99A)全细胞蛋白样品；第2泳道为重组大肠杆菌(含pTrC99A-Cj^/) 全细胞蛋白样品；第3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李迅，王婷，王亮亮，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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