本发明专利技术公开了一种杂交瘤细胞高密度灌流培养生产重组抗体蛋白的生产工艺，该工艺主要针对杂交瘤细胞代谢特征，筛选特定的培养成份进行灌流培养，在培养过程中充分补充代谢底物同时有效降低代谢副产物浓度，从而达到高效高产的目标。在过程控制方面，通过建立特异性灌流速率CSPR灌流培养计算模型，对培养参数进行实时计算，通过浓缩培养基分段流加，控制灌流速率，在补充葡萄糖及谷氨酰胺重要底物的同时，将副产物对培养的影响降低到最低。适用于杂交瘤细胞大规模培养制备生产用抗体蛋白，能够在较短时间内提供大量蛋白抗体，且规模小、投资低，能够在短时间内达到高效产出且批次差异低、可重复性高，能够达到抗体药物生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞工程领域的细胞工程技术，主要涉及杂交瘤细胞大规模培养及重组蛋白抗体生产，具体涉及一种杂交瘤细胞无血清高密度悬浮灌流培养工艺。
技术介绍
动物细胞培养工艺是动物细胞表达生物技术产品的生产工艺。这种工艺的研究， 是利用动物细胞的生物代谢过程，对其进行控制，解决工艺过程的共性与特性问题。该工艺研究的主要学科基础是细胞生物学和生物化学工程。相关的学科有遗传学、免疫学、分子生物学、生物化学、微生物学、化学工程学、应用物理和电子计算机等。它是一门由多学科基础综合组成而新兴的生物技术。因此，从事该项技术研究开发的人员，要尽可能掌握较全面的知识，并强调各相关学科之间的密切联系。动物细胞培养工艺在医药工业中的应用，主要是对在基础研究中获得的有价值的产品细胞株加以开发，对细胞株进行优化筛选，解决细胞本身的稳定性、产物与表达产量等问题。建立相关的质量标准，在运用工程技术手段，对产品细胞进行放大，工艺研究，以获得高效、高产量的生物医药产品。目前，在动物细胞工业化生产蛋白治疗药物中，较为成熟的工艺有流加培养工艺、 灌流培养工艺、批式培养工艺和反复批式培养工艺。其中流加培养和灌流培养，是当前动物细胞培养中占有主导优势的工艺方式。1996年1月至2002年12月，在美国获得批准的生物技术药物的诊断和治疗制剂产品共31种，其中用哺乳动物细胞培养生产的重组蛋白治疗药物的就有21种。在21种产品中，应用最多的动物细胞为CHO、SP2/0和NSO细胞。这些重组治疗药物主要是重组蛋白和抗体。在美国获得批准产品的工艺应用中，最有代表性的需求是生产产量与质量；其培养工艺的生产形式，至少有70%的是采用搅拌式悬浮培养生物反应器系统；50%以上采用无血清培养条件。除了传统的批式和流加生物反应器培养用于在重组细胞中生产治疗性蛋白，恒化和高密度灌流生物反应器被应用于越来越多哺乳动物细胞培养过程中，因为包含几个重要优点第一，不断添加新鲜的培养基并且通过稀释除去代谢副产物，如氨和乳酸(5，6)。第二，通过哺乳动物细胞外泌重组蛋白(相比于非外泌外源蛋白的细菌)无需等待批式培养结束后细胞破碎获取分泌蛋白产品，在过程中通过灌流可以连续不断获得产物。第三，相对于不断重复的批式培养过程，灌流培养可以保留对数生长期内的细胞， 以提高细胞活性和产能。第四，通过保留更多的活细胞，通过截流装置，细胞可以达到一个非常高的密度， 同时带白质的产率与细胞密度成正比，那么维持高的细胞密度就可以在灌流后期获得相对高的蛋白质产率。接下来，在细胞生长速率普遍低下的高密度灌流培养过程中，许多杂交瘤细胞系展现出高的比生产速率(单细胞)，从而使得蛋白质生产率显著提高。最后，蛋白质在灌流生物反应器内短暂的停留时间的有利于尽量减少他们与死亡细胞释放并积累蛋白酶，唾液酸酶及其他降解酶反应的时间，维持蛋白活性及产量。下表介绍灌流细胞培养产品发展的过程第一次工业规模灌流过程在20世纪80年代末，centocor生产用于治疗败血症的抗体药物entoxin。在1991年，该药品被核准在欧洲上市。但是在美国Centoxin未能通过临床试验随后停产。Centocor后来研发reopro并获得生产许可，并在1994年使用灌流技术大规模生产。同年Genzyme获得Cerezyme生产许可并采用灌流工艺进行生产。还有其它灌流培养产品，如 Gonal-F(Serano)，Remicade (Centocor), Refacto (Wyeth)，Kogenate-FS (Bayer)，和 Zigris(Eli-Lily)不断的上市。如表1所示，灌流培养生产的产品有庞大的市场。销售灌流培养为基础的药物意义重大，他们是数百万美元的药物。remicade是一种年产上百公斤的单克隆抗体，年销售额达到15亿美元。表1 灌流系统生产的用于市场的药品ProductCompanyYearSales(SM/year)CentoxinCentocor1991n/aCerezymeGenzyme1994740ReoProCentocor1994400Gonal-FSerono1997600RemicadeCentocor19981500ReFactoWyeth2000224Kogenate-FSBayer2000424ZigrisEli Lilly2001160值得注意的是，单克隆抗体的生产在杂交瘤细胞中长期连续生物反应器培养时存在不稳定现象。不过，这种在缓慢生长的杂交瘤细胞中逐渐产生的不稳定的抗体与重组细菌表达快速产生的不稳定异源蛋白有相当显著的差异。在哺乳动物细胞中生产的蛋白质会逐步损失，灌流生物反应器培养仍有足够的稳定时间，这个时间也许超过数周或数月，同时在类似规模的生物反应器相对于批式培养可以生产更多的蛋白质。因此，如果在灌流工艺条件下蛋白质稳定性能够得以保证，那么灌流生物反应器培养将成为一种优越的哺乳动物细胞大规模生产治疗性蛋白的运作模式。近些年，由于市场规模的扩大，灌流培养工艺由于其规模的限制，而逐步被流加培养工艺所取代。但是在抗体制备及药品研发阶段，灌流培养工艺仍因其独到之处而存在着广泛的应用价值。应用常规培养设备加装内部或外部高效稳定的截留装置，可以使得灌流培养在中试规模的发酵罐中获得工业化生产规模的培养体积。而且通过工艺参数优化，尤其是高密度培养条件下的灌流参数优化，在维持高密度培养的情况下，同等条件下灌流培养工艺的产率远高于流加培养，从而得到更多更好的产品。因而高效的灌流模型的开发成为了目前本领域的研究重点。Ozturk等人介绍了一种关于细胞灌流速率的理念，细胞特异性灌流速率(CSPR)。 通过应用底物产物平衡公式，设计、优化、控制灌流生物反应器。D ‘ (S0-S) = qs · XD · (P-P0) = qp · X其中D是稀释率，X是活细胞密度，S，P是底物和产品浓度；S。和Po分别为他们的起始浓度；qs和、表示底物利用速率和产物合成速率。将CSPR定义为CSPR = D/X，变换质量平衡方程为S = S0-qs/CSPRP = P0+qp/CSPR因此，如果csra作为一个常数，并且细胞活力不随时间和细胞密度改变，那么 CSI^R可以用于高密度生物反应器培养基组分衡定的操作控制，从而优化连续生产。使用csra模式控制的灌流生物反应器成功放大应用于中试规模。高度自动化的生物反应器控制系统使用光学密度电极监测细胞密度，实时测量氧消耗速率并结合测量对活细胞密度和细胞活力进行预估。然而该模式下运行的成本相对较高，对监测设备有相当高的要求。杂交瘤细胞在生长过程中对pH及渗透压等环境参数十分敏感。鉴于其在融合阶段所采用的细胞的特性，大规模高密度的细胞培养面临着一系列的挑战。我们知道在细胞培养过程中，葡萄糖作为主要碳源及能源物质，被连续摄入并且代谢，而代谢副产物乳酸对于培养环境的PH有巨大影响。在糖酵解代谢过程中，葡萄糖分解产生丙酮酸，在不完全氧化的情况下，生成乳酸。乳酸的大量堆积超过NaHCO3缓冲液的缓冲能力后，导致pH显著下降。在培养过程中具体表现为细胞对数生长期葡萄糖浓度的急剧下降和PH的下降成正比例关系。在细胞大规模培养过程PH是非常重要的过程参数，其主要调控手段包括关联补充 C02本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王彬，张征，张阳，屈颖，南刚，孙秀璇，徐力清，姚西英，王丽娟，
申请(专利权)人：陈志南，
类型：发明
国别省市：
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