一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种基因工程口服DNA疫苗及制备方法和应用，其步骤：A、鲤鱼生长激素成熟肽基因的制备：用鲤鱼脑垂体，提取其总mRNA后，通过RT-PCR得到总cDNA，设计并合成引物；B、融合基因sgh的制备；C、融合基因真核表达载体的构建：用限制性内切酶NheI,　XhoI双酶切pGEM-T-SGH和pcDNA3.1（-），胶回收开环质粒pcDNA3.1（-）和SGH基因的片段，连接后转化到感受态JM109中，得到阳性克隆子为JM109/pcDNA3.1(-)--signal-GH；D、质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌：将质粒转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumW0420感受态细胞中，得菌株SalmonellatyphimuriumW0420/pcDNA3.1(-)--signal-GH，为口服DNA疫苗。易于工业化生产，操作简单，成本低，安全性好。该疫苗具有转运促生长的DNA疫苗到克氏螯虾体内的能力，该DNA疫苗能够明显促进克氏螯虾幼虾生长；具有水产养殖业的应用前景。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因生物工程
更具体涉及一种基因工程口服DNA疫苗，同时还涉及一种基因工程口服DNA疫苗的制备方法，还涉及一种基因工程口服DNA疫苗的用途，具体涉及构建对虾抗菌肽Penaeidin-2信号肽与鲤鱼生长激素基因的融合基因sgh，并将融合基因构建到真核表达载体pcDNA3. 1-中，质粒pcDNA3. 1 (-)—signal-GH通过电转的方法转入到减毒的鼠伤寒沙门氏菌Mlmonella typhimurium W0420中，制备促进克氏螯虾生长的口服DNA疫苗。
技术介绍
生长激素(Growth Hormone, GH)是动物腺垂体细胞合成并分泌的一种具有种属特异性的单链蛋白质类激素，一般由186 191个氨基酸组成，分子量约为2. 1 2. 2KDa。 一般情况下，生长激素呈脉冲式分泌，其分泌受下丘脑产生的生长激素释放素(GHRH)的调节。生长激素作用机理较为复杂，生长激素的主要生理功能是促进神经组织以外的所有其他组织生长，能促进骨骼生长，蛋白质合成，对胰岛素有拮抗作用，并影响葡萄糖和脂类的代谢，与动物生长发育和繁殖等密切相关。鱼类生长激素(fish growth hormone, fGH)是由鱼脑垂体合成并分泌的一种蛋白多肽。鱼类生长激素参与体内蛋白质合成，脂类的代谢和降解等生理功能，能够显著提高鱼的生长速率，在水产领域里有较高的应用价值和市场前景。上世纪70年代中期研究学者首次分离到鱼类生长激素。1976年farmer等从罗非鱼脑垂体中分离得到生长激素。最初鱼类生长激素分离主要通过柱层析，再经过沉淀分级，从垂体的碱性提取物中获得生长激素。目前研究学者对鱼类生长激素的组成、结构、功能、基因调控等方面进行了较为系统的研究，并取得了一定的研究成果。通过基因工程技术将鱼类生长激素在大肠杆菌或酵母中高效表达。进一步的研究证实，在大肠杆菌或酵母中表达的鱼类生长激素通过喂食、肌肉注射、高渗浸泡等方法对鱼体具有显著促进生长作用。即通过基因工程技术表达重组鱼类生长激素与天然鱼类生长激素具有相似的生物活性和功能，目前重组鱼类生长激素已经应用于促进鱼，虾和贝类的生长。鱼类生长激素主要是通过激活靶细胞膜上的受体来实现其生物学活性，鱼类生长激素受体主要分布在肝脏细胞膜上，近年来研究发现鱼类生长激素也可以直接作用于其它组织细胞，如肾脏、心脏和肌肉等组织的细胞膜上。鱼类生长激素是新陈代谢的调节子元件，能促进鱼生长和发育，提高饵料中蛋白质转化效率，促进机体内蛋白质的合成，对糖类代谢的影响主要表现在可以促进肝糖原的消耗和增强对碳水化合物的利用能力。近年来有研究学者表明，鱼类生长激素能刺激卵巢细胞产生类固醇激素调节其性腺发育，鱼血清中生长激素水平与季节变化也存在一定的关系。研究学者阐明鱼生长激素对蛙科鱼类渗透压调节起到了重要作用。生长激素能够提高Na+-K+ATP酶的活性，同时抑制鱿科鱼类从淡水到海水迁移时引起的血浆渗透性和离子浓度提高。鱼类生长激素还能参与鱼类各种应激反应。1995年HJ Tsai和KLLin利用原核表达系统在大肠杆菌中表达黄鳍鲷生长激素， 并将表达的黄鳍鲷生长激素经复性纯化后注射到黄鳍鲷体内，12周后注射生长激素的实验组黄鳍鲷体长和体重与对照组比较分别提高了 22%和65% (HJTsai.，KLLinJ.，C Kuo. Highly efficient expression of fish growth hormone by Escherichiacoli cells. App 1. Envir. Microbiol, 1995,61 :4116-411.)。研究学者表明喂食外源生长激素能够增加鱼类蛋白质的合成，还可以增强鱼类对饵料中某些必需氨基酸的吸收。Sieridan等研究学者证实生长激素能提高鱼肝脏中脂肪酶活性，促进脂肪分解，以作为能量促进鱼类生长。生长激素作用途径有以下两种，一种是诱导肝细胞、肌细胞产生胰岛素样生长因子家族(insulin-like growth factor, IGFs)等生长介导素，再经胰岛素样生长因子间接起作用，IGF-I由70个氨基酸组成的单链多肽，分子量为7.6kDa，与胰岛素原约有50%的序列相似性。IGF-I通过与受体结合而发挥作用，其受体主要为IGFl受体(IGFlR)和IGF/ 胰岛素杂合受体。另一种是生长激素激活JAK2(JanUsKinase)，JAK2和生长激素受体(GHR) 磷酸化，并同磷酸化的受体一起将生长激素信号向下游传递。无论上述哪一种生长激素作用途径，生长激素都必须首先与细胞表面的特异性受体结合，通过受体的介导，激发一系列生化反应最终发挥其生物效应。生长激素还能通过JAK2介导胰岛素受体底物(IRS-1或 IRS-3)的磷酸化来激活磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(PI3-K/Akt)信号通路。2008年Arenal A等研究学者，将罗非鱼生长激素基因构建在真核表达载体中，通过胚胎电穿孔方法，将质粒导入到南方滨对虾胚胎受精卵中，PCR和Southern杂交分析有36%的幼虾中检测到罗非鱼生长激素基因，后续研究证实与对照组比较，南方滨对虫下幼虫下的体重有32%的增力口 (Arenal A.，Pimentel R. Growthenhancement of shrimp(Litopenaeus schmitti)after transfer of tilapia growth hormone gene. Biotechnol Lett, 2008, 30 (5) :845-851)。2007 年 Guti6rrez A 等将幼虾蜕皮阶段注射重组人活牛胰岛素，测定虾体血淋巴(肌肉，肝胰脏，鳃)中葡萄糖/糖原水平发现，注射后Ih 后血淋巴中血糖水平增加，并注射证后血糖水平开始下降。研究表明胰岛素很可能是在甲壳类动物中参与调节了糖代谢(Gutierrez Α.，Nieto J.，Pozo F.，Stern S.，Schoofs L. Effect of insulin/IGF-I like peptides on glucose metabolism in thewhite shrimp Penaeus vannamei . Gen Comp Endocrinol. 2007,153 :170-175.)。孙孝文等用显微注射法将生长激素基因导入中国对虾受精卵中，基因转移比例可以到达3%以上(孙孝文，刘萍等.显微注射生长激素基因导入中国对虾受精卵的研究.中国水产科学，1996， 3(4) :35-38)。DNA疫苗是指将编码某种蛋白质抗原的重组真核表达载体直接注射到动物体内， 使外源基因在机体内表达，产生的抗原激活机体的免疫系统，从而诱导特异性的体液免疫和细胞免疫应答。DNA疫苗具有减毒疫苗的优点，又无逆转的危险，因此越来越受到研究学者的重视，被看作是继传统疫苗及基因工程亚单位疫苗之后的第三代疫苗。DNA疫苗具有以下优点构建载体结构简单，提纯质粒DNA的工艺简便，适于大批量生产，生产成本较低；随着分子生物学技术的不断发展，DNA克隆比较容易，使得DNA疫苗能根据实际需求随时进行更新；质粒DNA分子较为稳定，可制成DNA疫苗冻干本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孟小林，徐进平，王健，
申请(专利权)人：武汉凯肽来生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：