早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法技术

本发明专利技术公开早期乳腺癌血清诊断试剂及其检测方法，所述诊断试剂采用的肿瘤标志物为hnRNPF，或者hnRNPF联合FTH1，检测待测血清中hnRNPF抗体，或者hnRNPF和FTH1的对应抗体，用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测；本发明专利技术开发的试剂，通过乳腺癌、乳腺良性肿瘤、其他癌症（非乳腺癌）患者及正常人血清应用的验证。本发明专利技术用于乳腺癌的早期诊断与鉴别诊断，旨在提高乳腺癌早期诊断的敏感性、特异性和准确率，更有利于乳腺癌患者的诊断和治疗。以此解决乳腺癌现有肿瘤标志物不理想问题，达到提高乳腺早期诊断敏感性和准确性的目标。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，特别是涉及。
技术介绍
乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤。研究显示，乳腺癌发病率占妇科肿瘤的31%，死亡率在肿瘤中居第二位，且近年来乳腺癌发病率有升高趋势，已成为威胁我国女性健康的首要恶性肿瘤。乳腺癌目前虽无特殊的预防措施，但是它属于一种早期易治易控的肿瘤，若能早期发现、早期诊断、早期治疗，预后情况一般比较好。临床上，部分乳腺癌因早期发现而取得了理想的治疗疗效，但大部分患者因发现较晚错失了最佳治疗时机。因此，当前以及将来相当长的一段时间内，争取早期诊断将是乳腺癌防治的一项基本策略。诊断早期乳腺癌的方式，在诊断发现方面主要是自查异常(如乳腺自查等)或医院体检(如采用乳腺钼靶X线摄影、乳腺彩色多谱勒超声检查、乳腺导管内视镜检查、乳腺导管灌洗、CT和磁共振等，若有无法辨别的肿块或脓肿可进行细胞学穿刺检查)，在确诊方面则为病理组织检查。但在临床中存在如下缺陷一、目前的自查异常或医院体检，在诊断的早期性提示方面仍显滞后，特别是对于那些由于肿块较小、或者浸润较轻、成膨胀性生长、 表现为光滑、活动、边界清楚，与良性肿瘤不易区别的早期乳腺癌患者，漏检率较高，或者当诊断发现时已过了最佳的早期治疗时机；二、由于涉及社会文化伦理等方面问题，一些年轻女性对于乳腺检查容易忽视或产生抗拒心理，上述的医院体检方法对处于早期阶段的乳腺癌患者，特别是年轻患者的诊断能力更为有限；三、病理学检查虽是肿瘤确诊的“金标准”， 但非手术患者作病理学检查存在取材所致的肿瘤细胞扩散风险等原因，因此不被普遍应用。目前，随着技术的发展，对于就乳腺癌方面的体检和未确诊者，大多作外周血乳腺癌相关指标的检查，其优点是简便可行，但仍存在如下缺点一、现有指标在早期的表达是微量的，且敏感性和特异性低，故检出率偏低；二、现有指标在临床诊断中相对不稳定，使部分患者错过早期诊断机会。另外，术后患者的疗效监察和复发诊断，也同样存在缺乏理想外周血检测指标的问题。因此，发现理想的早期诊断指标，其意义十分重大。目前在国内外，本领域当前的研究重点有如下四个方面①全基因组层面筛选新指标现有的血清学指标中，对乳腺癌诊断价值大的不多，特别缺少早期诊断有价值的指标。 缺乏理想诊断指标，原因可能是未能全面筛选相关指标；近年来全基因组表达的检测已有较大突破，可以进行噬菌体展示技术、全基因组芯片技术等检测，因此国内外已开始从全基因组层面筛选各类肿瘤新的、有价值指标，这种方案可以发现新的诊断指标，故成为研究热；ο②多指标联合诊断模型的开发肿瘤标志物诊断价值未达到预期目标的另一原因，可能是肿瘤不同类型、不同时期表达的指标不同有关，因此期望用单一指标解决各阶段的诊断问题不现实。国内外已有多指标联合诊断的研究报道，本课题组曾对12种常用指标联合诊断进行研究，取得较好效果。 多指标联合诊断，能提高诊断的准确度。③寻找外周血中能反映肿瘤早期病变的指标在以外周血检查为主要手段筛查肿瘤的现阶段，外周血指标是否理想，决定着早期诊断效果的好坏。对多数肿瘤而言，目前仍缺少理想的诊断指标。肿瘤特异蛋白最早表达在病灶组织，但这种表达在早期是微量的，加上即使病灶组织表达，也未必分泌到外周血，所以有必要从早期表达指标中找出能分泌到外周血中的指标。近年有试图利用抗体为指标， 实现早期诊断的研究；其理论依据是，病灶细胞一旦有表达蛋白的改变，就会通过免疫学反应产生相应的抗体，抗体可以从血液中检测到，并且现有方法学可以检测到血液中微量的抗体。除此，还有检测外周血中微转移肿瘤细胞、微RNA为诊断指标的研究、DNA水平的基因突变等。④新方法学的开发和应用方法学的灵敏度、特异性是评价其优劣的重要标准，蛋白检测主要有蛋白芯片技术、噬菌体展示技术、酶免疫技术等，mRNA检测主要有核酸芯片技术、RT-PCR技术等。噬菌体展示技术是近年用于新指标筛选的重要手段。噬菌体展示技术构建肿瘤蛋白文库，以此筛选血清中特异性指标已有部分报道， Zhong Li等报道了肺癌中的研究结果，取得较好效果，其产品诊断非小细胞肺癌的敏感性达90 %、特异性达95 %，都远远地高出现有的任何其它诊断方法。国内外文献报道的类似研究，主要还局限在肺癌、前列腺癌和卵巢癌，而在乳腺癌方面的报道并不多见。从发展趋势看，乳腺癌等的诊断指标筛选，主要是从全基因组层面展开；蛋白质是直接起生理作用的物质形式，因此也较DNA或RNA层面的研究更有价值；噬菌体展示技术可表达导入的单个基因，便于特定蛋白的针对性研究。因此，应用噬菌体展示构建全基因组蛋白文库，筛查新的蛋白质指标，已成重要研究趋势。有鉴于此，本专利技术人作为专门从事乳腺癌诊断检测的医生，结合在该领域多年工作的经验，对上述问题及前沿技术进行长期跟踪研究，本案由此产生。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服乳腺癌现有肿瘤标志物不理想问题，旨在提高乳腺癌早期诊断的敏感性、特异性和准确率，利用一种特异性、敏感性强的诊断标志物制备诊断稳定性好、检测方便的用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的诊断试剂。本专利技术用于乳腺癌的早期诊断与鉴别诊断，更有利于乳腺癌患者的诊断和治疗，达到提高乳腺早期诊断敏感性和和准确性的目标。本专利技术的另外一个目的在于提供一种进行乳腺癌早期诊断或术后疗效监测的方法。为实现上述目的，本专利技术的技术方案如下早期乳腺癌血清诊断试剂，所述诊断试剂以hnRNPF，或者hnRNPF联合FTHl为诊断标志物，可检测分离的待测血清中hnRNPF抗体，或者hnRNPF与FTHl的对应抗体，用于乳腺癌早期诊断或术后疗效监测。早期乳腺癌血清诊断试剂，包括hnRNPF ELISA板，hnRNPF ELISA板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的hnRNPF抗原或商业化购得的hnRNPF抗原包埋酶标板，4°C过夜， 洗涤后5% BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合hnRNPF ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；hnRNPF ELISA板可由酶标仪于 450 nm波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据 hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值进行判断，比值彡2. 0，判断为阳性，比值< 2. 0，判断为阴性，阴性对照OD值低于0. 05作0. 05计算，高于0. 05按实际OD 值计算。进一步，早期乳腺癌血清诊断试剂还包括FTHl ELISA板，FTHl ELISA板先由应用乳腺癌T7噬菌体特异表达的FTHl抗原或商业化购得的FTHl抗原包埋酶标板，4°C过夜，洗涤后5%BSA/PBS室温封闭2小时形成；还包括可配合FTHl ELISA板对待测血清进行检测的HRP偶联的山羊抗人IgG、显色剂A、B和终止液；FTHl ELISA板可由酶标仪于450 nm波长处读取OD值，以先后经噬菌体、鼠抗噬菌体一抗和羊抗鼠HRP 二抗包被的加样孔作为阴性对照孔，以未包被噬菌体的加样孔作为空白对照孔；用空白对照孔调零后，根据FTHl ELISA 板待测血清OD值/阴性对照平均OD值的比值，结合hnRNPF ELISA板待测血清OD值/阴性对本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：董学君，李志国，
申请(专利权)人：绍兴市人民医院，
类型：发明
国别省市：