革兰氏阴性菌灭活疫苗、其制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种革兰氏阴性菌灭活疫苗、其制备方法及应用，特别涉及仔猪水肿病灭活疫苗、及其制备方法和应用。研究发现在制备过程中加适量氨苄青霉素钠，能够诱导类志贺毒素变异体二型毒素大量产生，使疫苗中含有一定类毒素抗原成分。本发明专利技术以仔猪为检验模型评价疫苗的安全性和免疫效力，观察此制备方法应用于疫苗后该疫苗安全性和免疫效力的影响，并确定了氨苄青霉素钠在菌液培养中添加量，即：将该抗生素加入到培养基中至每毫升菌液中含有氨苄青霉素钠浓度为5μg/ml时，能够刺激该菌产生足够的毒素抗原，并不影响细菌繁殖，培养物种既含有毒素抗原又含有足够量的菌体抗原，能够有效提高疫苗中类毒素含量，保障疫苗免疫效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种能诱导细菌产生毒素的抗生素，尤其涉及氨苄青霉素钠在诱导革兰氏阴性菌产生类志贺变异体二型毒素中的应用，还涉及由此制备得到的灭活疫苗及其制备方法，更涉及一种仔猪水肿病灭活疫苗的制备方法，本专利技术属于畜牧兽医
领域。
技术介绍
常规疫苗在生产过程中其抗原的主要来源为菌体抗原，因此菌体用量大且副反应发生率高，但免疫保护率不高。研究发现，疫苗中含有一定的类毒素抗原，能够与菌体抗原协同作用能较好地提高疫苗免疫效果。类志贺变异体二型毒素是革兰氏阴性菌培养中产生一种外毒素，主要存在于培养基中和细胞外膜内，是一种蛋白毒素，是该细菌的主要毒力因子之一，戊二醛能将其完全脱毒，变成类毒素，因而具有较好的免疫原性。氨苄青霉素钠别名氨苄西林钠；氨苄青霉素；安比西林钠；氨苄青。为广谱半合成青霉素，本专利技术通过实验证明该抗生素具有刺激细菌产生毒素的作用。戊二醛，带有刺激性气味的无色透明油状液体，溶于热水。对细菌有较好的杀灭作用，对该毒素均有较好脱毒作用，将毒素变为类毒素本专利技术属于畜牧兽医
临床选取具有产毒素基因的标准菌株，培养中培养基中加适量氨苄青霉素，使其大量产生水肿毒素，经戊二醛溶液灭活脱毒制备疫苗，疫苗较常规疫苗除菌体抗原外，还含有一定的类毒素抗原。疫苗分别免疫免疫小鼠和仔猪，评价其免疫原性及安全性。试验表明，该疫苗可有效预防猪水肿病的发生，安全性和免疫原性可靠，免疫保护率达80%以上。高疫苗安全性和免疫效力如何？迄今为止，尚没有任何文献对此进行披露。
技术实现思路
本专利技术通过实验证明氨苄青霉素钠具有刺激细菌产生毒素的作用，尤其是能够诱导革兰氏阴性菌产生类志贺变异体二型毒素，因此本专利技术的目的之一是提供氨苄青霉素钠在诱导革兰氏阴性菌产生类志贺变异体二型毒素中的应用，在本专利技术的一个具体实施例中，所述革兰氏阴性菌为致仔猪水肿病大肠杆菌。本专利技术还进一步提供了氨苄青霉素钠在制备革兰氏阴性菌灭活疫苗中的应用。本专利技术的目的之二是提供一种革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，本专利技术的一种革兰氏阴性菌灭活疫苗的制备方法，其特征在于将单株或多株革兰氏阴性菌分别接种于含氨苄青霉素钠的营养肉汤中，培养，经纯粹检查合格后作为制苗用菌液，菌液经灭活后制备成单价或多价灭活疫苗，优选的，所述培养基中含有的氨苄青霉素钠的浓度为5μ g/ml。本专利技术所述的方法，其特征在于具体的，包括以下步骤(1) 一级菌种繁殖将单株或多株冻干革兰氏阴性菌菌种分别接种营养肉汤，36 37°C培养16-20小时后，用划线分别接种于麦康凯琼脂平板，置36 37°C培养16 20小时，在低倍镜下，分别选取菌落5-10个混合接种于营养肉汤，然后分别接种于营养琼脂斜面，置36 37°C培养16 20小时，用营养肉汤分别洗下菌种加10% (w/w)甘油，_20°C保存，使用期不超过6个月或斜面培养物置2 8°C保存，不超过1个月，纯粹检验合格，作为一级种子；(2) 二级菌种繁殖取一级种子分别接种于营养肉汤，置36 37°C震荡培养16 20小时，取样作纯粹检查，纯粹检查合格后，置2 8 °C保存；(3)菌液培养用玻瓶或生物发酵罐通气培养，将二级菌种分别接种于含5 μ g/ml氨苄青霉素钠的营养肉汤，37°C培养16 18h，经纯粹检查合格后作为制苗用菌液；(4)菌液灭活得到的菌液以总量0. 4% (w/w)加入戊二醛溶液，经37°C灭活48小时；所述的菌液为一种革兰氏阴性菌菌液或多种革兰氏阴性菌菌液的混合物，按活菌计数，将各菌株菌液按111比例混合；(5)疫苗的制备在检验合格的灭活菌液中加入终浓度为20% (w/w)的氢氧化铝凝胶和0. 005%(w/w)的硫柳汞防腐，制备浓缩灭活疫苗，按灭活前活菌数计算，制备浓缩灭活疫苗含单株菌数均不低于100 Xl 08CFU/ml。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的革兰氏阴性菌为致仔猪水肿病大肠杆菌。本专利技术的目的之三是提供由以上任一所述的方法制备得到的革兰氏阴性菌灭活疫苗。在本专利技术的一个具体实施例中，所述的疫苗为仔猪水肿病灭活疫苗，更优选的所述的疫苗为仔猪水肿病多价灭活疫苗。本专利技术的目的之四是提供所述的灭活疫苗在制备治疗由感染革兰氏阴性菌引起的疾病药物中的应用。及所述的灭活疫苗在制备治疗猪水肿病药物中的应用。本专利技术的上述目的是通过以下技术方案来实现的一种能够有效提高细菌发酵培养时，产生大量水肿毒素的抗生素，该抗生素为氨苄青霉素钠；本专利技术通过将氨苄青霉素钠应用于细菌发酵培养中，提高了细菌产毒素量，增加疫苗含类毒素含量，优选的该抗生素最小抑菌浓度为5 μ g/ml。本专利技术通过试验发现，氨苄青霉素添加到培养基中，培养致猪水肿病大肠杆菌时能显著提高水肿毒素的量，水肿毒素为该病原的主要致病因子之一，该毒素脱毒后成为类毒素，具有免疫原性；现销售的疫苗多为全菌灭活疫苗，免疫原性不尽理想，疫苗添加抗类毒素成分能显著提高一秒的免疫效力。同时对疫苗的安全性不受影响。为了达到更好的免疫保护效果，将抗生素加入到培养基中至每毫升疫苗中含有氨苄青霉素那5 μ g/ml ；该毒素用戊二醛脱毒彻底，优选戊二醛最小灭活浓度为0. 4% (w/w)。本专利技术以小鼠和仔猪为实验模型，观察此生产工艺制备的疫苗对小鼠和仔猪安全性和免疫效力，并确定氨苄青霉素钠在培养集中在最佳添加量，以及灭活剂戊二醛的最佳灭活脱毒条件。本专利技术中所述的疫苗优选具有产毒素基因的标准大肠杆菌，更优选为仔猪水肿病多价灭活疫苗。具体实施例方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本专利技术的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本专利技术的精神和范围下可以对本专利技术技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本专利技术的保护范围内。实施例1仔猪水肿病多价灭活疫苗制备一、试验材料1.生产菌种猪大肠杆菌C83684、C83905、C83903株，购自中国兽医药品监察所。2.培养基营养琼脂平板和营养肉汤按《兽药典》附录方法制备。3.麦康凯琼脂购自北京奥博星生物技术有限责任公司；硫柳汞钠盐购自中国第二军医大学药学院药物研究室；氨苄青霉素钠购自哈药集团制药总厂。4.氢氧化铝凝胶可按常规方法制备或从市面上购买得到，本实施例中氢氧化铝凝胶由哈药集团生物疫苗有限公司自制。具体的，可按照以下方法制备得到取5000g的明矾加入到30000ml的蒸馏水中，煮沸，充分搅动使其完全溶解，静置沉淀过夜，吸取上清液转入另一容器内，将上清液加热至80°C，缓慢搅拌，边搅拌边加入氨水约2000ml，直至充分反应成粘稠的氢氧化铝胶凝胶后，将凝胶转入到帆布袋中，过滤去除水分后，再加入生理盐水至帆布袋容积的3/4处，使其充分混勻，如此反复洗涤6次，收获氢氧化铝胶凝胶。按中华人民共和国兽药典三部2010版附录34页进行检验合格后，置2-6°C保存备用。二、制备方法(1) 一级菌种繁殖将冻干菌种接种营养肉汤，37°C培养18小时后，用划线接种于麦康凯琼脂平板，置37°C培养18小时，在低倍镜下，选取菌落5-10个混合接种于营养肉汤，然后接种于营养琼脂斜面，置37°C培养18小时，用营养肉汤洗下加10% (w/w)甘油，-20°C保存，使用期不超过6个本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：白同臣，曲海波，孟福强，赵辉，王华，
申请(专利权)人：哈药集团生物疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：