本发明专利技术公开了检测结肠腺癌相关基因启动子甲基化引物，本发明专利技术提供的检测待测ＤＮＡ的甲基化引物，为如下１）：１）所示的引物由引物对Ａ－Ｆ组成；所述引物对Ａ由引物１和引物２组成；所述引物对Ｂ由引物３和引物４组成；所述引物对Ｃ由引物５和引物６组成；所述引物对Ｄ由引物７和引物８组成；所述引物对Ｅ由引物９和引物１０组成；所述引物对Ｆ由引物１１和引物１２组成；所述引物１－１２的核苷酸序列为序列表中的序列１－１２；本发明专利技术的实验证明，本发明专利技术提供的检测ＤＮＡ甲基化的引物控制引物Ｔｍ值使其在６０℃，保证ＰＣＲ产物的特异性和扩增效率，它们能高效地检测结肠腺癌和腺瘤样本的甲基化状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种生物
，尤其涉及一系列检测结肠腺癌相关基因启动子甲基化引物。
技术介绍
肿瘤相关特异基因的启动子CpG区域的甲基化修饰与肿瘤发生和形成相关。值得关注的是，不同类型的肿瘤以及同一肿瘤的不同病理分型和分级，会发生特异的基因甲基化修饰，因此，肿瘤相关基因的甲基化状态已经成为一类重要的肿瘤检测标志物，可用于肿瘤早期检测、肿瘤预后评价和药物敏感性预测和评价。共轭聚合物为基础的荧光共振能量转移技术(Cationic conjugated polymer-basedfluorescence resonance energy transfer, CCP—FRET)能提 1 检测白勺敏感性和特异性，将这个技术应用于甲基化半定量分析，具有高效、成本低廉、操作简单、无需标记技术和特殊设备优点。而传统的DNA测序方法操作繁琐，敏感性较低；Real time PCR尽管具有较高的敏感性，但是它的成本较高，此外，对检测仪器的需求也限制了其在临床的实际应用。因此，CCP-FRET方法有希望成为临床常规检测方法。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供检测待测DNA甲基化的引物。本专利技术提供的引物，为如下1)或2)1)所示的引物由引物对A-引物对F组成；所述弓丨物对A由引物1和引物2组成；所述弓丨物对B由引物3和引物4组成；所述弓丨物对C由引物5和引物6组成；所述引物对D由引物7和引物8组成；所述引物对E由引物9和引物10组成；所述引物对F由引物11和引物12组成；所述引物1-引物12的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列1-12 ；2)所示的引物为所述引物对A-引物对F中的至少一种。上述引物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因 CpG位点的甲基化；上述弓丨物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述弓丨物对B具体用于检测MGMT基因CpG位点的甲基化；上述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；上述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG位点的甲基化；上述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因 CpG位点的甲基化；上述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG位点的甲基化。上述的CpG位点为CCGG ；上述各引物均独立包装。本专利技术的另一个目的是提供一种检测待测DNA的甲基化的PCR试剂。本专利技术提供的PCR试剂，为如下1)或2):1)所示的PCR试剂包括PCR试剂A1-PCR试剂Fl ；所述PCR试剂Al由所述引物对A、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Bl由所述引物对B、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Cl由所述引物对C、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Dl由所述引物对D、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂El由所述引物对E、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；所述PCR试剂Fl由所述引物对F、dNTPs、PCR扩增缓冲液和DNA聚合酶组成；2)所示的PCR试剂包括PCR试剂Al-Fl中的至少一种。1)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2 ；2)所示的PCR试剂还包括PCR试剂A2-PCR试剂F2中的至少一种；所述PCR试剂A2-PCR试剂F2为将所述PCR试剂A1-PCR试剂Fl中的dNIPs替换为 dNTlV ；所述dNIPs，由荧光素标记的dATP、荧光素标记的dGTP、dATP、dCTP和dTTP组成。1)所示的PCR试剂由PCR试剂A1-F1和PCR试剂A2-F2组成；2)所示的PCR试剂由PCR试剂Al-Fl中至少一种和与其对应的PCR试剂A2-F2中至少一种组成；所述荧光素为购于中国同位素公司。每条所述引物在对应的所述PCR试剂中的终浓度均为400nM。上述弓丨物对A用于检测VIM基因的甲基化；所述引物对A具体用于检测VIM基因 CpG位点的甲基化； 上述弓丨物对B用于检测MGMT基因的甲基化；所述弓丨物对B具体用于检测MGMT基因CpG位点的甲基化；上述引物对C用于检测TMEFF2或HPPl基因的甲基化；所述引物对C具体用于检测TMEFF2或HPPl基因CpG位点的甲基化；上述引物对D用于检测ESRl基因的甲基化；所述引物对D具体用于检测ESRl基因CpG位点的甲基化；上述引物对E用于检测APC基因的甲基化；所述引物对E具体用于检测APC基因 CpG位点的甲基化；上述引物对F用于检测MLHl基因的甲基化；所述引物对F具体用于检测MLHl基因CpG位点的甲基化。上述的CpG位点为CCGG。每一种所述PCR试剂均为独立包装。含有的所述引物或含有所述试剂的试剂盒也是本专利技术保护的范围。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化中的应用也是本专利技术保护的范围。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在检测或辅助检测待测DNA的甲基化程度中的应用也是本专利技术保护的范围。上述应用中的所述甲基化程度体现在甲基化比值。上述的引物、上述的PCR试剂、上述的试剂盒在制备检测或辅助检测癌症产品中的应用也是本专利技术保护的范围；所述癌症为结肠腺癌或结肠腺瘤。用于检测CCP-FRET方法的基本原理和步骤涉及到HpaII消化处理待检测DNA，如果待测DNA中发生甲基化，HpaII识别的序列被保护，那么DNA序列是完整。因此，当以处理过的DNA为模板进行PCR扩增，就能得到特异性的PCR产物。该方法所用的PCR与常规的PCR不同的是，在PCR反应过程中，掺入了荧光素标记的dNTP，使共轭聚合物和荧光素标记的产物发生明显的能量共振转移，根据化合物和荧光素之间的荧光共振能量转移信号可以确定所述待测DNA的目标CpG位点或序列的甲基化状态。本专利技术的实验证明，本专利技术提供的检测DNA甲基化的引物包含了两个或者两个以上的5’-CCGG-3’序列，因此，能够真实特异地反应该基因的甲基化状态，而且在引物的设计方面也避免了链内和链间互补问题，降低背景干扰。此外，我们通过优化引物的碱基组成和长度来控制引物Tm值使其在60°C，保证PCR产物的特异性和扩增效率，它们能高效地检测结肠腺癌和腺瘤样本的甲基化状态。以下各实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。 附图说明图1为应用引物1和2进行RCR扩增VIM琼脂糖凝胶电泳2为检测VIM甲基化的能量共振转移效率图3为应用引物1和2检测样本VIM基因启动子甲基化4为应用弓丨物1和2检测VIM甲基化敏感性分析图5为应用引物3和4进行RCR扩增MGMT琼脂糖凝胶电泳6为检测MGMT甲基化的能量共振转移效率图7为应用引物3和4检测样本MGMT基因启动子甲基化8为应用弓丨物3和4检测MGMT甲基化敏感性分析图9为应用引物5和6进行RCR扩增TMEFF2/HPP1琼脂糖凝胶电泳10为检测TMEFF2/HPP1甲基化的能量共振转移效率图11为应用引物5和6检测样本TMEFF2/HPP1基因启动子甲基化12为应用弓丨物5和6检本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种检测待测ＤＮＡ甲基化的引物，为如下１）或２）：１）所示的引物由引物对Ａ－引物对Ｆ组成；所述引物对Ａ由引物１和引物２组成；所述引物对Ｂ由引物３和引物４组成；所述引物对Ｃ由引物５和引物６组成；所述引物对Ｄ由引物７和引物８组成；所述引物对Ｅ由引物９和引物１０组成；所述引物对Ｆ由引物１１和引物１２组成；所述引物１－引物１２的核苷酸序列依次分别为序列表中的序列１－１２；２）所示的引物为所述引物对Ａ－引物对Ｆ中的至少一种。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王树，
申请(专利权)人：中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：11
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