本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA及其应用。该shRNA以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列作为其靶序列，所述的靶序列为：SEQ?ID?NO.10。该shRNA真核表达质粒是将所述的shRNA的模板与线性化的载体pGPU6/GFP/Neo连接得到分别针对乙型脑炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。本发明专利技术所提供的shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，涉及一种能抑制JEV复制与感染的shRNA及其应用。
技术介绍
乙型脑炎(Japanese encephalitis, JE)是由乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)引起的一种严重的人畜共患虫媒病毒性疾病。该病对人类危害巨大，是人类中枢神经系统最常见的虫媒病之一，广泛分布于亚洲，特别是远东一些国家和地区。近年来其流行分布范围不断扩大，流行频率也不断增强。乙脑病毒属于黄病毒科黄病毒属。病毒粒子呈20面体对称，在核酸外面包有致密的脂蛋白囊膜。JEV基因组为单股正链RNA分子，本身具有传染性。其基因组编码产物为3 个结构蛋白(C、prM、E)和 7 个非结构蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NSQ。乙脑属于自然疫源性疾病，蚊虫是该病的主要传播媒介。本病的发生与气候环境有着密切的关系，呈明显的季节性。我国一般流行高峰在7、8、9三个月。多种动物均可感染本病，感染后成为传染源。经检查发现，在流行病区，畜禽的隐性感染率均很高，特别是猪，其次是马和牛。病毒在感染动物血液内存留时间很短，主要存在于中枢神经系统及肿胀的睾丸内，但猪感染后病毒血症期维持时间长，血液中病毒滴度高，对乙脑的传播起重要作用。同时，猪是乙脑传播给人类最重要的宿主，一般情况下JEV的感染呈猪-蚊-人链状。 猪感染乙脑时间的早晚和感染率的高低与人乙脑的流行密切相关。感染后，人、猴、马和驴出现明显的脑炎临诊症状，病死率较高。猪群不发生脑炎症状，怀孕母猪可表现高热、流产、 死胎和木乃伊胎，死产胎儿出现脑缺损症状，公猪则出现睾丸炎，给养猪业发展带来巨大的损失。RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指双链RNA介导的序列特异的基因沉默现象。RNA干扰现象最初在植物和低等生物中被发现，随着研究的深入，近来在高等的真核生物中也被发现，并且证明是一种重要的进化保守现象。已证明短的双股干扰RNA (siRNA)是由dsRNA特异的核酸内切酶，Dicer酶，剪切而来。RNA诱导沉默复合物(RISC)是由siRNA 和一种多酶复合物结合构成，它位于mRNA特定的部位，并且发挥核酸内切酶和外切酶的活性来作用mRNA。除了在转录水平的基因沉默(降解mRNA)，siRNA也被证明通过DNA甲基化沉默启动子而降低蛋白表达。短发卡RNA(shRNA)通常利用载体导入细胞，并且可被传递到子代细胞中去，从而使基因沉默可被遗传。shRNA的发卡结构可被细胞机制切割成siRNA， 然后按上述机制达到降解mRNA的目的。它最大的优点在于具有高度的有效性和特异性并且具有快速的防御与治疗效果。它的作用在基因功能研究领域和各种疾病的治疗领域尤其是病毒性疾病的治疗领域已显示出不可估量的价值，例如在抗艾滋病毒(HIV)，丙型肝炎病毒(HCV)，乙型肝炎病毒(HBV)和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)等病毒的研究中都发现 RNAi对于抑制这类病毒的复制效果极好，可能为这类病毒病的治疗创立新的，更有效的途径。毫无疑问，随着对RNAi机制的深入了解以及技术的进一步完善，RNAi技术必将为生命科学研究和临床疾病的防治带来新的革命。乙型脑炎的流行是世界性的公共卫生问题之一。目前对于乙脑尚无特效治疗手段，因此预防乙脑的发生尤为重要。而传统的疫苗生产不能满足人类日益发展的需要，因而，科研人员不断地寻求新的治疗方式。RNAi这项新兴技术即是其中颇有潜力的新途径。 目前，国内外运用RNAi治疗乙脑还处在科研院所的理论研究中，并未大规模地投入到临床治疗中，但其研究结果显示出卓越的抑制病毒复制与感染的能力，在临床治疗中有着极大的潜力与良好的前景。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能快速、特异和显著抑制JEV在动物细胞与个体中复制和感染的shRNA及其应用。本专利技术的另一目的是提供含有该shRNA的真核表达质粒及其应用。本专利技术的目的可通过如下技术方案实现一种能抑制乙型脑炎病毒复制与感染的shRNA，以乙型脑炎病毒基因组中高度保守的序列SEQ ID NO. 10作为其靶序列，该shRNA的正义链模板序列为SEQ ID NO. 3，反义链模板序列为SEQ ID NO. 4。一种含所述的shRNA的shRNA真核表达质粒，该shRNA真核表达质粒是将所述的 shRNA的模板与线性化的载体pGPTO/GFP/Neo连接得到针对乙型脑炎病毒E基因mRNA序列的shRNA真核表达质粒。所述的shRNA真核表达质粒在制备抑制乙型脑炎病毒复制和/或感染的药物中的应用。本专利技术的有益效果先向动物细胞中转染本专利技术的shRNA真核表达质粒，再用病毒攻击细胞进行一系列试验(图4 图8)，结果表明本专利技术的shRNA可有效地抑制JEV在细胞上的复制，对细胞有良好的保护作用。先将本专利技术的shRNA真核表达质粒注入动物体内，再用不同剂量的病毒攻击动物机体(图10A、B)；或者将本专利技术的shRNA真核表达质粒与不同剂量的病毒同时注入动物体内(图10C、D)，结果表明本专利技术的shRNA均能有效地降低动物的发病率和死亡率，动物存活率达50%以上，显著高于无干扰作用组。可见，本专利技术的shRNA真核表达质粒在动物个体水平上既有良好的预防JEV感染的作用也有治疗JEV感染的功效。综上所述，本专利技术所提供的shRNA以及shRNA真核表达质粒能够在制备治疗和/ 或预防JEV感染的药物中应用，为治疗和预防JEV感染提供一种新的可选药物。附图说明图IJEV基因组结构及本专利技术中所选取的保守区段示意图。箭头处为shRNA所选的靶基因位点。图 2pGPU6/GFP/Neo 载体结构图。图3shRNA真核表达质粒的酶切鉴定。M :lamda/Ecol30I ;A1_5和Bl_5分别为 pGP-El 与 pGP-E2BbsI 酶切结果；A，1-5 和 B，1-5 分别为 pGP-El 与 pGP_E2BamHI 酶切结果； C1-5 和 D1-5 分别为 pGP-NS3 与 pGP_NS4b BbsI 酶切结果；C，1-5 和 D，1-5 分别为 pGP_NS3 与pGP-NS4bBamHI酶切结果。图4 间接免疫荧光结果。A、B、C、D、E、F分别是pGP_E 1、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock组结果。图5经shRNA作用后的细胞培养液的TCID5tl的测定结果。图6 流式细胞术结果。A、B、C、D、E、F 分别是 pGP-El、pGP-E2、pGP-NS3、pGP_NS4b、 pGP-NC和Mock组结果。图7Real time RT-PCR结果。mRNA的相对表达量是指经过shRNA干扰作用后JEV 的目的基因3’段非编码区的表达量与阴性对照组目的基因表达量的比值。图 8Western blotting 结果。泳道 1 6 分别为 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、 pGP-NS4b、pGP-NC 和 Mock 组结果。图9 免疫组化结果。A、B、C、D、E、F 分别是 pGP-El、pGP_E2、pGP_NS3、pGP_NS4b、 Virus control 和 Mock 组结果。图10本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：沈婷，陈溥言，刘珂，曹瑞兵，周斌，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：
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