本发明专利技术公开了一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为：GCAACAGCAACATGGTTTcartaytayac的引物G1，下游引物溶液含有序列为：CTTCTTCATTCATATTTCCATGCarnccyttytc的引物G2，引物中5＇端非兼并共有序列在不增加引物简并度的情况下能稳定3＇兼并核心区与模板结合作用，提高了兼并PCR反应的特异性，可以扩增检测汉坦病毒属内各类病毒，如汉滩型病毒、汉城型病毒、普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、安第斯病毒型和索托帕拉雅型病等，防止国外流行株传入国内，也能对与扩展基因同源的未知病毒进行检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及汉坦病毒的检测技术，具体涉及涉及一种汉坦病毒群的简并RT-PCR 检测方法。
技术介绍
汉坦病毒属(Hantavirus)仅有一个病毒群，即汉坦病毒群(简称汉坦病毒)，属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae)。根据汉坦病毒基因分子结构和抗原性的不同，将汉坦病毒至少分为34个血清型/基因型，包括汉滩型病毒(Hantaan Virus)，汉城型病毒(Seoul Virus)，普马拉型病毒(Puumala Virus)，多不拉伐型病毒(Dobrava Virus)，图拉型病毒 (Tula virus)，索托帕拉雅型病毒(Thottapalayam virus)和安第斯型病毒(Andes virus) 等。汉坦病毒能感染野生啮齿动物和人类，引发人类的肾综合征出血热(HFRS)和汉坦病毒性肺综合症(HPS)。这些病遍及亚洲、欧洲、非洲、美洲、大洋洲等70多个国家，其流行之广， 危害之重，已成为全球性的公共卫生问题。我国汉坦病毒的感染情况更为严重，世界汉坦病毒感染每年报告的病例数大约在150,000 200，000之间，而我国发病人数则占世界报道病例数的90%以上，是受汉坦病毒危害最为严重的国家。我国流行的主要是肾综合征出血热，近十年来我国年报告发病人数一直稳定在4 6万人，而且新疫区不断出现，并时有爆发。汉坦病毒的检测方法主要有病毒分离、血清学检测方法和基因检测方法。基因检测方法主要是反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，与血清学抗体检测相比在灵敏性和特异性上的都大幅度提高。目前汉坦病毒的RT-PCR检测方法中均只针对汉坦病毒中的汉滩病毒型和/或汉城病毒型使用特异性型引物进行RT-PCR检测，如授权公告号为CN101294226的专利技术专利，就公开了以汉滩型病毒和汉城型病毒的各基因型为目的片断设计了二对引物的试剂盒，用于检测汉滩型病毒和/或汉城型病毒；该试剂盒无法检测出汉坦病毒属内的其它病毒。虽然目前国内疫区大多数为汉滩型病毒和汉城型病毒感染，但随着进出口贸易量的增大，国外流行株(普马拉型病毒、多不拉伐型病毒、图拉型病毒、安第斯型病毒和索托帕拉雅型病毒等)传入不可避免，因些防止国外流行株传入以及未知型别病毒的发生的检测显得尤为重要，目前还未有对汉坦病毒属全病毒通用的PCR检测方法的公开报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，该简并RT-PCR检测方法不仅可以用于检测国内流行的汉滩型和汉城型病毒，还可以用于检测国外其它流行株，防止国外流行株传入国内。本专利技术解决上述技术问题所采用的技术方案为一种汉坦病毒群的简并RT-PCR 检测方法，包括下述步骤a、RNA提取用RNA提取试剂盒(购自Qiagen公司)提取病毒的RNA，得到RNA，具体提取方法依说明书进行；3b、RNA逆转录用RNA逆转录试剂盒(购于Promega公司)对上述RNA进行RNA逆转录， 得到PCR模板，具体逆转录方法依说明书进行在0.2mL印pendorf管中加入oligo d(T)15 primers(50mM/ L)lyL，上述 RNA 50ng(约 10 μ L)，72°C 10. min，加入 5XRT buffer4 μ L, dNTP 液(IOmM / L) 1 μ L、AMV 反转录酶液(IOU/ μ L) 1 μ L、RNA 酶抑制剂(20U/ μ L)0. 5 μ L、 无RNA酶水1.5μ ，42τ lh，72°C IOmin ；反应产物即为后续的PCR模板；c、PCR反应在 0. anL 印pendorf 管中加入 10 XPCR 缓冲液(PCR buffer) 2. 5 μ L、浓度为25mM/ L的MgCl2溶液1. 5 μ L、浓度为IOmM/ L的dNTP液0. 5 μ L、浓度为5U/μ L 的Taq酶液0. 5 μ L、上游引物溶液1 μ L、下游引物溶液1 μ L，上述PCR模板2 μ L，灭菌去离子水16 μ L，组成PCR反应体系；反应条件为94°C预变性5min，94°C变性30s，52°C退火 30s, 720C延伸lmin，35个循环，72°C延伸7min，得到PCR产物，4°C保存；所述上游引物溶液含有浓度为25mM/ L的引物G1，所述引物Gl的核苷酸序列为GCAACACCAA CATGGTTTca rtaytayac，所述下游引物溶液含有浓度为25mM/L的引物G2，所述引物G2的核苷酸序列为 CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc ；其中r为嘌呤，可以是g或a，y为嘧啶，可以是 c或t/u，η是任何碱基，可以是g或a或c或t/u或其它；d、琼脂糖凝胶电泳将上述PCR产物用1-1.5%浓度琼脂糖凝胶电泳检测目标条带，电泳条件电压100v，30min，将电泳结果用凝胶成像系统分析，若结果出现478bp大小片段的条带，则为汉坦病毒群。(以上PCRbuffer、MgCl2, dNTP液、Taq酶液等反应试剂均购自大连宝生生物，引物由上海生工合成。上述引物Gl、G2是根据Genbank已公布12个基因型病毒株L片段全片段基因设计弓I物对，包括 Dobrava-Belarade viru strain D0BV/Ano-Poroia/Af 19/1999, Hantaan virus strain 76-118,Seoul virus 80-39, Hantavirus zlO,Sin Nombre virus(NM H10) ,Tula virus strain Tula/Moravia/5302v,Andes virus strain Chile-9717869,Puumala virus strain Samara-49/CG/2005,Thottapalayam virus virus strain VRC 66412,Amur virus Khekhtsir/AP209/2005 ,Prospect Hill virus PH-l,Rio Mamore virus HTN—007。 将蛋白序列以FASTA格式保存，将下载的FASTA格式的氨基酸序列信息输入http:// blocks, fhcrc. org/codehop. html进行Block比对，得到高度保守的连续氨基酸区域。使用 CodeHop引物搜索，常规方法筛选合适上下游引物。要求简并度低，上下游引物位置间距在 500bp左右。利用primer和oligo软件进行引物分析，得到上述1对简并杂合寡核苷酸引物(引物Gl和引物G2)，通过Megalian与Genbank中现有L全片段毒株共52株比对，理论上均可得到478bp的扩增产物，国内外尚无对于汉坦病毒属通用引物的研究报道。与现有技术相比，本专利技术的优点在于一种汉坦病毒群的简并RT-PCR检测方法，通过RNA提取、RNA逆转录、PCR反应和琼脂糖凝胶电泳，PCR反应中上游引物溶液含有序列为GCAACAGCAA CATGGTTTca rtaytayac的引物Gl，下游引物溶液含有序列为CTTCTTCATT CATATTTCCA TGCarnccyt tytc的引物G2，引物Gl和引本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：胡群，郭利平，马思杰，谢东华，韩辉，
申请(专利权)人：中华人民共和国大榭出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：
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