本发明专利技术公开了一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，它采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物。应用本发明专利技术的LAMP检测试剂盒，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫，解决了现有技术检测时间长、工作量大、交叉污染、操作复杂等缺陷，具有特异性强、敏感性高、快速且成本低、操作方法更简单，特别适于基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及牡蛎单孢子虫检测领域，尤其是一种牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。
技术介绍
单孢子虫(Haplospori dium sp)对牡蛎养殖的危害较大，主要感染牡蛎血细胞、 结蒂组织和消化道上皮，可引起牡蛎较高的死亡率，在美洲、大洋洲和亚洲等国家的感染普遍存在。单孢子虫的传统检测方法有电镜观察、组织细胞学检查、原位杂交等，这些方法费时费力，缺乏专一性，在实际工作中具有一定的局限性。目前，虽已建立起单孢子虫PCR和荧光定量PCR检测方法，其检测敏感性也比较高，但是常规PCR需要使用PCR仪和进行凝胶电泳，荧光定量PCR则需要使用更加昂贵的荧光定量PCR仪和试剂等，，因而难以适应基层现场检测需要。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种特异性强、敏感性高、仪器要求低、操作快速简便且成本低的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，以满足基层现场快速检测牡蛎单孢子虫的需要。为解决上述技术问题本专利技术采用如下技术方案牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒，该试剂盒含有以下试剂反应液A 含有IOX等温反应缓存液、Bst DNA聚合酶8U/ul、IOmM dNIPs、25mM硫酸镁、20uM的内引物l、20uM的内引物2、20uM的外引物l、20uM的外引物2、20uM的环引物1、20碰的环引物2、511甜菜碱、6251^钙黄绿素和12.5mM氯化锰；IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和曲拉通X-100 ；内引物 1 序列为 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG，内引物 2 序列为 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG，外引物1 序列为 GACGATCAGATACCGTCG，外引物2 序列为 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA，环引物1 序列为 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG，环引物2 序列为 ACGGAAGGGCACCACCAGAT。反应液A每管Mul，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物2、0.5ul5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和5. 5ul双蒸水。本专利技术采用环介导等温扩增(LAMP)技术，并根据牡蛎单孢子虫共有的基因保守区(见序列表SEQ. ID. No. 1)设计了两个特异性内引物、两个特异性外引物和两个特异性环引物，由此专利技术了用于快速检测牡蛎单孢子虫的牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒。应用本专利技术的LAMP检测试剂盒建立牡蛎单孢子虫检测方法，仅需通过对组织样品进行DNA提取并进行环介导等温扩增，即可检测出牡蛎单孢子虫。该法无需昂贵的PCR仪只需普通水浴锅，却比PCR检测有更高的灵敏度，且不必通过凝胶电泳观察结果，操作简单而快速，特别适用于基层现场检测。另外，常规的LAMP方法，需要在反应结束后开盖加入STOR Green I或Gene Finder染料来显色，容易造成假阳性一方面，反应产物易形成气溶胶而污染周围环境造成假阳性；另一方面，SYBR Green I或Gene Finder染料还会由于引物二聚体而引起假阳性。因此，本专利技术使用内加钙黄绿素+氯化锰替代了外加的STOR Green I和Gene Finder 染料，即在配置LAMP反应液时就加入反应液中而无需LAMP反应后再开盖加入；而且，钙黄绿素+氯化锰仅在发生LAMP反应时才出现绿色，避免了 STOR Green I和Gene Finder染料带来的假阳性问题，所以具有更好的特异性。附图说明图1是应用本专利技术牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法特异性试验结果图。图1中1单孢子虫，2折光马尔太虫，3副溶血弧菌，4派琴虫，5溶藻弧菌，6河弧菌，7拟态弧菌，8牡蛎组织。图2是应用本专利技术牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的检测方法敏感性试验结果图。图2中1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA Ing/管，IOOpg/管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。图3是PCR方法检测牡蛎单孢子虫敏感性试验结果图。图3中M为IOObp DNA ladder, 1-8分别为以下不同浓度的牡蛎单孢子虫DNA Ing/ 管，IOOpg/ 管，IOpg/ 管，Ipg/ 管，IOOfg/ 管，IOfg/ 管，Ifg/ 管，0. Ifg/ 管。具体实施例方式一、牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒的配制反应液A 每管Mul，其组成为2. 5ul IOX等温反应缓存液、1. Oul Bst DNA聚合酶8U/ul、3ul IOmM dNTPs,3ul 25mM硫酸镁、0. 25ul 20uM的内引物 1、0. 25ul 20uM的内引物2、2ul 20uM的外引物l、2ul 20uM的外引物2、Iul 20uM的环引物1、Iul 20uM的环引物 2、0.5ul 5M甜菜碱、Iul 625 μ M钙黄绿素和Iul 12. 5mM氯化锰和5. 5ul双蒸水。其中，IOX等温反应缓存液含有200mM pH值为8. 8的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和1 %曲拉通X-100。内引物 1 序列为 AGTCCGAAAACTTTGATTTCTCTCATAGTCCCAACTATAAACTATGTCG (见序列表 SEQ. ID. No. 2)，内引物 2 序列为 GGAGTATGCTCGCAAGGGTGGTCAAATTAAGCCGCAGG (见序列表 SEQ. ID. No. 3)，外引物1 序列为 GACGATCAGATACCGTCG(见序列表 SEQ. ID. No. 4)，外引物2 序列为 TGGTAAGTTTTACCGTGTTGA(见序列表 SEQ. ID. No. 4)，环引物1 序列为 GGAAGTAAACTTGCCCAATGCTTAG(见序列表 SEQ. ID. No. 6)，环引物 2 序列为 ACGGAAGGGCACCACCAGAT (见序列表 SEQ. ID. No. 7)。二、应用本专利技术牡蛎单孢子虫LAMP检测试剂盒检测牡蛎单孢子虫的方法(以下简称LAMP检测法)1、组织样品中DNA的提取使用北京天跟生物工程公司的海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒(商品名海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒，型号DP3M-0;3)提取组织DNA，浓度能达到20ng/ul。2、牡蛎单孢子虫LAMP反应以提取的牡蛎单孢子虫DNA为模板，在装有MyL反应液A管中加入1 μ L待检 DNA构成25ul反应体系；LAMP反应程序如下62°C 60min，然后80°C 5min。直接用肉眼观察颜色变化，如颜色变为绿色，则说明样品中含有牡蛎单孢本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种牡蛎单孢子虫ＬＡＭＰ检测试剂盒，其特征在于该试剂盒含有以下试剂：反应液Ａ：含有１０×等温反应缓存液、Ｂｓｔ ＤＮＡ聚合酶８Ｕ／ｕｌ、１０ｍＭ ｄＮＴＰｓ、２５ｍＭ硫酸镁、２０ｕＭ的内引物１、２０ｕＭ的内引物２、２０ｕＭ的外引物１、２０ｕＭ的外引物２、２０ｕＭ的环引物１、２０ｕＭ的环引物２、５Ｍ甜菜碱、６２５μＭ钙黄绿素和１２．５ｍＭ氯化锰；所述１０×等温反应缓存液含有２００ｍＭ ｐＨ值为８．８的三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、１００ｍＭ氯化钾、１００ｍＭ硫酸铵、２０ｍＭ硫酸镁和１％曲拉通Ｘ－１００；所述内引物１序列为ＡＧＴＣＣＧＡＡＡＡＣＴＴＴＧＡＴＴＴＣＴＣＴＣＡＴＡＧＴＣＣＣＡＡＣＴＡＴＡＡＡＣＴＡＴＧＴＣＧ，所述内引物２序列为ＧＧＡＧＴＡＴＧＣＴＣＧＣＡＡＧＧＧＴＧＧＴＣＡＡＡＴＴＡＡＧＣＣＧＣＡＧＧ，所述外引物１序列为ＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣＧＴＣＧ，所述外引物２序列为ＴＧＧＴＡＡＧＴＴＴＴＡＣＣＧＴＧＴＴＧＡ，所述环引物１序列为ＧＧＡＡＧＴＡＡＡＣＴＴＧＣＣＣＡＡＴＧＣＴＴＡＧ，所述环引物２序列为ＡＣＧＧＡＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＣＡＧＡＴ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：谢芝勋，谢丽基，庞耀珊，刘加波，邓显文，谢志勤，
申请(专利权)人：广西壮族自治区兽医研究所，
类型：发明
国别省市：45
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。