青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用制造技术

本发明专利技术公开了青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用。本发明专利技术所提供的青蒿bHLH转录因子，是如下a)或b)的蛋白质：a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。本发明专利技术将bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本发明专利技术调控青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
中青蒿bHLH转录因子及其编码基因与应用。
技术介绍
bHLH家族转录因子是真核生物所独有的一类转录调控因子，具有碱性/螺旋-环-螺旋元件，该转录因子可以与特异顺式元件E-box(CANNTG)结合并参与转录。研究表明，bHLH转录因子在真核生物中普遍存在。在动物体内，bHLH家族蛋白在生物的生长发育调控过程中起着极为重要的作用，它们参与调控神经元发生、肌细胞生成、血细胞生成、 性别决定和肠组织发育。在植物中，对bHLH转录因子的研究主要集中在生化和次生代谢两个方面。例如，它参与拟南芥皮毛的分化，并且可以调控光调控基因比如CCAl (circadlan clock associated 1)和LHY(late elongated hypocotyl)的表达。在植物次生代谢研究中发现， 转录因子的表达控制常常能够改变次生代谢物的代谢途径。比如，bHLH转录因子的过表达可以使花青素在矮牵牛植株内各个组织中积累；在拟南芥和玉米中也有相似的情况。同时在对玉米黄酮类生物合成途径的遗传分析中发现bHLH基因家族调控黄酮类基因的表达。药用植物青蒿合成一种倍半萜类次生代谢产物青蒿素，它是我国首创的新型抗疟疾药，被世界卫生组织认定为21世纪替代奎宁的最有效的抗疟疾药物。同时，进一步的研究中发现青蒿素还具有抗癌活性。目前青蒿素的主要来源还是仍然是通过传统工艺从植物青蒿中进行提取，但是植物中青蒿素的含量只有干重的0. -0.8%，无法满足国内外疾病治疗的需求。研究发现，青蒿素合成量的多少主要是由其合成途径中的多个合成酶活性表达所决定的，这些合成酶的活性表达受到相应的转录因子及其它调控基因的调节，其中，转录因子对合成基因的转录激活是植物次生代谢最为重要的调节环节之一。转录因子通过激活植物次生代谢物合成途径中多个合成基因的表达，可有效地启动或关闭次生代谢合成途径， 从而调节特定次生代谢物的合成。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供青蒿bHLH转录因子及其编码基因。本专利技术所提供的青蒿bHLH转录因子，名称为AabHLHl，来源于青蒿(Artemisia annua)，是如下a)或b)的蛋白质a)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；b)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与青蒿素合成相关的由a)衍生的蛋白质。本专利技术所提供的青蒿bHLH转录因子的编码基因，为如下1)或2)或3)所示1)其核苷酸序列是序列表中序列1所示DNA分子；2)在严格条件下与1)限定的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；3)与1)或2)限定的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。上述严格条件可为用6XSSC，0. 5% SDS的溶液，在65°C下杂交，然后用2XSSC， 0. 1 % SDS 和 1 X SSC, 0. 1 % SDS 各洗膜一次。序列表中序列1由1950个碱基组成，编码具有序列表中序列2所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列2由649个氨基酸残基组成。含有所述青蒿bHLH转录因子的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本专利技术的保护范围。所述重组表达载体为在表达载体pBI122的多克隆位点插入所述编码基因得到的重组表达载体。扩增所述青蒿bHLH转录因子的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本专利技术的保护范围。所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。所述青蒿bHLH转录因子、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在如下1)或2)中的应用也属于本专利技术的保护范围1)提高与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；2)降低与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用。所述1)中的应用为提高植物组织中与促进青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；所述2)中的应用为降低植物组织中与抑制青蒿素合成相关的酶的编码基因的表达量中的应用；所述植物组织为青蒿叶片。所述与促进青蒿素合成相关的酶为紫穗槐二烯合酶、青蒿醛Δ 11 (13)双键还原酶、细胞色素Ρ450单加氧酶或醛脱氢酶；所述与抑制青蒿素合成相关的酶为二氢青蒿醛还原酶。所述青蒿bHLH转录因子、所述编码基因、所述重组表达载体或所述表达盒、转基因细胞系或重组菌在制备青蒿素中的应用也属于本专利技术的保护范围。本专利技术通过酵母单杂交分析证明bHLH转录因子可以与特异顺式元件 Ε-box (CANNTG)结合并参与转录。将该bHLH转录因子瞬时转化到青蒿植株内过表达，其所调控的青蒿素生物合成代谢中的关键酶表达量大幅度提高，可以用来生产青蒿素。本专利技术调控青蒿素合成的方法解决了原料的限制问题，且生产工艺简单，有利于青蒿素的大规模工业生产。相比一般的用关键酶进行青蒿植株基因工程改造，通过bHLH转录因子对青蒿素次生代谢途径调节有诸多优点1)克服了酶底物的负反馈作用；2)可以激活青蒿素代谢支路中多个基因的协同表达；幻转录因子还可激活不同植物中相似次生代谢反应途径。因此，以bHLH转录因子为工具对青蒿进行次生代谢调控无疑具有较大的优势。附图说明图1为pET: AabHLHl原核表达载体的示意图。4图2为AabHLHl蛋白EMSA电泳图。图 3 为 pHIS-E_boxX3 和 pGADT7 AabHLHl 载体示意图。图4为AabHLHl在酵母细胞中与E_box的相互作用。图5为pBI AabHLHl植物表达载体示意图。图6为青蒿素生物合成途径示意图。图7为AabHLHl瞬时转化青蒿叶片后对青蒿素代谢合成途径关键酶进行的半定量 RT-PCR分析。CK, pBI121对照；1，AabHLHl瞬时转化青蒿。图8为亚细胞定位植物表达载体pBI AabHLHl-GFP的示意图。图9为AabHLHl的核定位分析结果图。具体实施例方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。实施例1、与青蒿素合成相关蛋白及其编码基因的获得与功能验证一、获得与青蒿素合成相关蛋白及其编码基因AabHLHl使用天根生物技术公司植物RNA提取试剂盒提取青蒿(Artemisia annua)(青蒿种子采集自中国重庆市酉阳地区)植株的叶片的总RNA，采用天根生物技术公司反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。以该cDNA为模板PCR扩增AabHLHl转录因子基因。PCR扩增所用引物为PEl和PE2，PEl和PE2的核苷酸序列如下PEl :5，-GATAAGCTTGCATGACGGAGTACCGCATGAATC-3> (下划线部分表示 HindIII 识别位点)；PE2 :5，-GTAGCGGCCGCCTACAGCTTCGCTAATTGCCTTAAC-3’ (下划线部分表示 NotI 识别位点)。PCR 反应条件为95°C变性 4min ;94°C 30s,54°C 30s,72°C 90s，30 个循环；72°C 延伸lOmin。PCR扩增出1950bp的片段，回收后经过Hindlll/NotI双酶切后连接到pET30a载体(购自Novagen公司本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种蛋白，是如下ａ）或ｂ）的蛋白质：ａ）由序列表中序列２所示的氨基酸序列组成的蛋白质；ｂ）将序列表中序列２所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和／或缺失和／或添加且与青蒿素合成相关的由ａ）衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王红，冀云鹏，马东明，郝鹤，李星，
申请(专利权)人：中国科学院研究生院，
类型：发明
国别省市：11