本发明专利技术属于分子生物学领域，涉及棉花细胞S期(DNA合成期)激酶蛋白相关基因SKP1及其应用，该基因具有SEQ?ID?NO.4所示的cDNA序列和SEQ?ID?NO.6所示的DNA序列，其编码产物氨基酸序列为SED?ID?NO.5。包括该基因超表达载体的构建、超表达载体质粒的遗传转化以及应用。研究发现，该基因参与了SCF复合体的形成并调控着植物雄性减数分裂、生长素、赤霉素、脱落酸、茉莉酸和乙烯等生理发育过程，并且与植物的生长发育有密切关系。因此，本发明专利技术对于研究该基因对植物生长发育的影响，具有重要的意义。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，涉及棉花细胞S期(DNA合成期)激酶蛋白相关基因 SKPl及其应用。
技术介绍
SCF复合体的名称最初源于发现的三个组成部分SKPl (DNA合成期激酶相关蛋白)、Culin/CDC53(细胞周期蛋白依赖性激酶)和F_box(F盒子)。在生物体内，选择性降解蛋白是一种重要的功能调节机制。而真核生物中，泛素/26S蛋白酶体是目前了解比较多的一种降解途径，而SCF复合体又是降解途径中泛素连接酶E3的组成成分。因此SCF复合体在泛素/26S蛋白酶体降解途径中起着比较重要的作用。SKPl，即 S 期激酶相关蛋白 1 (S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PR0TEIN1, SKP1)，是真核生物中普遍存在的一类蛋白，是泛素连接酶SCF复合体的核心单位。SKPl参与SCF复合体的形成，还参与生物发育过程的多个代谢途径，调控着包括植物减数分裂过程及生长素、 赤霉素、茉莉酸、乙烯和脱落酸等激素代谢过程。拟南芥中对此基因的研究表明，SKPl基因功能的缺失，会出现雄性不育突变体。目前，国内外棉花中对此基因的研究尚未有报道。因此，棉花中对此基因功能的研究，为进一步创造雄性不育突变体奠定了基础。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供棉花有丝分裂S期激酶蛋白相关基因SKP1。为研究SKPl在棉花中的生物学效应奠定了基础。本专利技术还要解决的技术问题，是提供上述基因SKPl的应用。为解决上述技术问题，本专利技术采用的技术方案如下一种棉花有丝分裂S期激酶蛋白相关基因SKP1，该基因来源于陆地棉(Gossypium hirsutum L.)，具有如SEQ ID NO. 4所示的cDNA序列和如SEQ ID NO. 6所示的DNA序列。编码上述棉花有丝分裂S期激酶蛋白相关基因SKPl的氨基酸序列如SED ID NO. 5 所示。该蛋白是小分子量蛋白，其主要的生物学功能在于参与SCF((联会复合体))复合体的形成，是SCF复合体的核心亚单位，从而调控生物体内泛素介导的蛋白质降解，并参与多方面的生物发育过程。上述基因SKPl的超表达载体，为含有所述基因SKPl的植物表达载体PBI121。所述基因SKPl在棉花雄性不育系的不育株雄蕊中表达量高于其他组织中的应用。所述基因SKPl及所述基因SKPl的超表达载体在抑制烟草种子萌发、抑制烟草主根生长以及提高烟草激素含量中的应用。有益效果本专利技术用RACE方法克隆到了棉花S期激酶蛋白1相关基因SKP1，提供了一种棉花S期激酶蛋白1基因序列及其编码蛋白质序列和应用。①该基因表达量在棉花雄性不育系中抗A的不育株雄蕊高于可育株雄蕊，且同一植株雄蕊表达量高于雌蕊，说明此基因很有可能与棉花的雄性不育有关。②在雄蕊、胚根、幼根、幼茎等分化能力比较强的组织中表达量比较高，说明该基因与植株的生长发育可能有一定的关系。本专利技术构建了 35S =SKPl重组表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化方式转化烟草验证功能。为研究SKPl在棉花中的生物学效应奠定了基础。通过转基因烟草Tl代分析， 在整个萌发过程中，SKPl的过量表达延缓了种子的萌发，降低了萌发率。在萌发50小时后转基因株系中某种激素或者化学物质出现了量的变化。转基因株系主根长度都短于野生型 CK, SKPl基因超表达影响了烟草的根系生长发育过程。超表达SKPl还影响了植株体内各种激素含量的变化。附图说明图1棉花RNA的提取。图2SKP1中间片段PCR，M :Marker2000,1为目的片段。图 33，-RACE 片段 PCR，M :Marker2000。图 45，RACE 片段 PCR，M :Marker2000。图 5cDNA 全长 PCR，M :Marker2000, 2 为目的片段。图6基因组全长PCR，M :Marker2000,1为目的片段。图7植物超表达载体的阳性克隆。图8重组表达载体PCR检测。图9重组表达载体酶切鉴定，1号泳道已经酶切开，2号泳道为对照。图10转基因烟草Tl代抗性筛选，已经转入的植株可以健康生长。图11转基因烟草Tl代PCR检测，1-7是转基因植株，Marker2000, CK未转基因植株。图12SKP1在雄性不育系中的时空表达。图13转基因植株Tl代种子萌发统计。图14转基因植株主根短于非转基因植株。图15转基因植株Tl代主根长度的测量。图16a转基因植株Tl代激素ABA含量的测定。图16b转基因植株Tl代激素IAA含量的测定。图16c转基因植株Tl代激素GA含量的测定。图16d转基因植株Tl代激素观含量的测定。具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本专利技术。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本专利技术，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本专利技术。实施例1 陆地棉(Gossypium hirsutum L.)棉花DNA和RNA的提取。棉花DNA的提取参照FANG等人的DNA提取方法, Biotechniques, 1992，13 :52-56.]；棉花RNA的提取参照蒋建雄和张天真改进的CTAB法提取总RNA.棉花学报，2003，15 (3) :166-167]。实施例2 :cDNA的制备。参照The first-strand cDNA Synthesis Kit 试剂盒说明书(TaKaRa，Japan)。实施例3 :RT-PCR中间片段的获得。(1)根据拟南芥SKPl基因的保守区设计简并引物(预计350bp左右大小)。前引物:5-GA(T/C) GG (C/T) GA (G/A) (A/G/T) (A/T/C) (A/G/T/C) TT (C/T) GAGGT-3 ；后引物5-ATCTC(T/C) TC (A/G/C/T) GG (A/T/G) GT (T/C) TT (C/G/T) CC-3。(2)25ul 反应体系为前引物 Iul，后引物 Iul，d NTP (2. 5mM) 2ul，10X 缓冲液!3ul， MgCl22ul，模板 lul，ddH20 14. 8ul，Taq 酶 0. 2ul(3) RT-PCR反应程序(图 2) :94°C，3m ；94°C，30s ；51 °C，45s ；72°C，70s，；35 个循环； 72°C, IOmin0(4)送上海生工测序，测序结果如SED ID N0. 1。(5)测序结果在NCBI上比对，与蓖麻、烟草、杨树、拟南芥等多个物种的SKPl基因同源性很高。实施例4 :3，RACE (3，片段的获得)。(1)引物3， CDS(12uM) :5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30V N-3‘；(N = A, C, G, or T ;V = A, G, or C)；NUP :NUP(10 μ Μ)) 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3‘；3' GSP 5' -GGGACGCTGACTTTGTCAAGGTCG-3‘；3' NGSP 5' -ATTCTGGCAGCGAACTATTTGAACATC-3‘；10X UPM (通用引物混合物)；0. 4μΜ 长引物5 ‘ -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGA本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．棉花有丝分裂Ｓ期激酶蛋白相关基因ＳＫＰ１，其特征在于，该基因来源于陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ ｈｉｒｓｕｔｕｍ Ｌ．），其ｃＤＮＡ序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．４所示，其ＤＮＡ序列如ＳＥＱ ＩＤＮＯ．６所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：唐灿明，胡德龙，陈全战，张朝军，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：84
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