本发明专利技术公开了一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株的构建及重组水蛭素的生产工艺。其中采用汉逊多型宿主细胞株RB-11为出发菌株来构建适用于生产的含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6，并通过培养、发酵来获得高纯度和高含量的水蛭素。在本发明专利技术中，水蛭素基因以多拷贝的形式拷贝到宿主细胞的染色体上，且拷贝数保持稳定，含有水蛭素基因的外源基因表达盒完全整合到宿主细胞染色体上，种子库细胞、传代40、80代后的细胞中均无游离质粒存在，外源蛋白的表达量和分泌效率比酿酒酵母高10倍，特别和国内的多型汉逊酵母相比水蛭素外源蛋白的表达量高35.8％，且没有过度糖基化现象，因此适合于大规模发酵生产目的蛋白。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种胞外型蛋白表达基因的真核汉逊酵母工程菌的构建，更具体地说，涉及一种含有水蛭素基因的工程菌株及其构建、生产水蛭素的方法。
技术介绍
水蛭在我国中医已有几千年的使用历史，是一种不可缺少的活血中药。水蛭素是水蛭唾液腺分泌的具有强抗凝活性的小分子蛋白质，主要为一种含65个氨基酸的多肽，分子量在7000左右，含3个二硫键，已分离鉴定7种异构体。水蛭素因为具有与凝血酶极强的亲和力，在很低的浓度下就能中和凝血酶，起到抗凝作用，可广泛应用于器官移植等手术。 水蛭素具有的溶纤作用使其具有较强的溶栓作用，能够抑制各种动物实验中的DIC(弥漫性血管内凝血)的形成。通过家兔试验证实水蛭素对预防和治疗动脉粥样硬化具有潜在的应用价值。此外水蛭素对促进脑血肿吸收，减轻周围脑组织炎症反应及水肿，缓解颅内压增高，并改善出血水肿局部血液循环，保护脑组织免遭破坏以及抑制肿瘤细胞的生长都有显著作用。利用基因工程技术获得有重要生物学活性的蛋白质是现代生物技术的重要目标。 在实现体外表达蛋白质的过程中，努力提高表达量的同时，最大限度地保持产物的空间结构和生物学活性与天然蛋白一致是很重要的。酵母表达系统是研究真核蛋白质表达和分析的有力工具，拥有转录后加工修饰功能，适合于稳定表达具有一定功能的外源蛋白质。具有表达系统操作简便，成本低廉，可大规模进行发酵等优点，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。中国专利申请“一种重组水蛭素编码基因与应用”(申请号2008101031M. 8， 申请日2008年3月31日，公开日2008年8月27日)公开了一种利用多形汉逊酵母进行水蛭素的生产，但是其外源蛋白的表达量和分泌效率较低，且会产生过度糖基化现象，因而在适应于大规模发酵生产方面存在严重不足。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种含有医用水蛭素基因的重组真核汉逊酵母工程菌株及其构建方法。本专利技术的目的还在于提供一种利用上述重组工程菌株生产水蛭素的生产方法。本专利技术的技术目的通过下述技术方案予以实现本专利技术提供的一种重组医用水蛭素编码基因，其序列是序列表中SEQ ID No. 1所述的核苷酸序列；其编码的多肽，其特征是具有序列表中SEQ ID No. 2所述的氨基酸序列。本专利技术提供一种重组水蛭素编码基因的重组表达载体，其为如附图2所示的表达载体 PMPiTaRBHV。本专利提供的一种水蛭素真核汉逊酵母工程菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC No. 5227，保藏日期为2011年9月7日，分类命名为异常毕赤酵母Pichia anomala。细胞为球形和伸长的球形(1. 5-4. 6) X (1. 9-5. 3) μ m,以单个、成对或成群的方式出现。生长的菌落为奶油样tarmish白。在同化培养基表面生长偶而产生非常薄的膜。在生态琼脂Dalmau板25°C培养七天后在盖玻片下可探测出菌丝和假菌丝。所述水蛭素真核汉逊酵母工程菌的出发菌株为汉逊多型宿主细胞株RB-Il (直接购自德国莱茵生物公司)。RB-Il细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp. R et al. ，1986 Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorphs by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202 :302-308)。 RB-Il细胞株为5'-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。所述重组表达载体导入汉逊多型宿主细胞株(如RB-11)中可获得含有重组水蛭素编码基因的重组菌，其外源蛋白表达为[iieSThi^-es位脱硫基水蛭素。本专利技术公开了水蛭素真核汉逊酵母工程菌的构建方法，按照下述步骤进行(1)构建含有重组水蛭素基因及酿酒酵母信号肽基因序列的穿梭质粒pUCaRBHV ；(2)构建含有目的基因序列的表达载体pMPTaRBHV ；(3)将步骤(2)的表达载体pMPTaRBHV用完整细胞转化法转化汉逊酵母菌，经筛选获得含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株。其中所述汉逊酵母菌优选为汉逊酵母菌(Hansenula)RB-ll。RB-Il直接购自德国莱茵生物公司)。RB-Il细胞株为LR9细胞株的改良衍生株(Roggenkamp. Ret al. ，1986Transformation of the methylotrophic yeast Hanseunla polymorphs by autonomous replication and integration vectors, Mol. Gen Genet 202:302-308)。 RB-Il细胞株为5'-乳清酸核苷磷酸脱羧酶缺陷型突变株，已被广泛应用与工业重组菌的构建。所述含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株编号为RBHV145-6，已于2011年 9月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏号为 CGMCCNo. 5227。本专利技术还提供一种利用工程菌株进行医用水蛭素生产的方法，按照下述步骤进行(1)利用含有水蛭素的汉逊酵母高表达工程菌株RBHV145-6进行培养，选出高品质亚克隆细胞株，对菌株进行遗传性的全面鉴定，制成原始菌株；(2)将部分原始菌株进行培养后冷冻保藏，作为日后生产使用的细胞种子库；(3)将步骤( 冷冻保藏的生产使用的菌株在转速为IOOrpm的条件下，37°C培养预发酵40h，然后将预发酵的发酵液接种到装有7. 5L培养基的10L发酵罐中，设定pH为 4 士 0. 2，转速为500rpm，换气量为10L/min，温度为30°C ；(4)以甘油单碳源来控制生长分泌在发酵开始的20 30h内，酵母生长的OD6tltlnm 值达到40左右，氧分压下降到不到10% ；接下来一直到发酵结束的过程中，pH为4士0.3， 转速和换气量分别为700rpm和15L/min，设定氧分压为40 %左右，根据发酵过程中氧分压的变化进行补料；(5)待发酵结束后，采用扩张柱床阳离子交换层析和反相层析的方法进行产品的分离和纯化。所述步骤(4)中，接下来一直到发酵结束的过程为去阻遏过程，用时约为 110-115h，最佳为 112h。利用本专利技术的技术方案进行生产和纯化后，用Angilent 1100型高效液相检测其水蛭素的含量达到1. 5g/L。用Angilent 1100型高效液相及C8柱检测分离出来的产品，大部分是由65个氨基酸组成的水蛭素，其含量占整个蛋白含量的95%，这一步水蛭素总的收率为68%。由反相层析出来的中间品经冻干浓缩后，很好的保持了重组水蛭素的比活性，重复生产十余批，比活性均保持在18，000ATU/mg以上。经对多批中试产品全面自检，DNA重复测序证实65个氨基酸序列正确，氨基酸测序证实N-末端15个aa序列正确。质谱分析显示分子量为7000Da左右，且几批中试产品肽图分析基本一致。ELSA测量几批中试品德残余宿主蛋白小于0. 1% ；残余DNA小于本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种医用水蛭素编码基因，其特征在于，具有序列表中ＳＥＱ ＩＤ Ｎｏ．１所述的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：元昊，杨力，
申请(专利权)人：元昊，杨力，
类型：发明
国别省市：12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。