能支持未分化的人胚胎干细胞在化学成分确定的培养基中培养的合成表面，其包括可溶胀(甲基)丙烯酸酯层和偶联于该可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的肽。所述可溶胀(甲基)丙烯酸酯层可通过聚合组合物中的单体形成，所述组合物包含甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯。偶联的肽可包含XaanProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetPro所示氨基酸序列，其中n是0-3的整数，Xaa是任何氨基酸。本文还公开了可通过γ辐射灭菌的可溶胀(甲基)丙烯酸酯合成表面。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养制品，更具体地说，涉及用于在化学成分确定的培养基中支持未分化干细胞培养的合成表面和制品。
技术介绍
多能干细胞，如人胚胎干细胞(hESC)具有分化为三种胚层中的任一种的能力，从而在人体中形成任何成人细胞类型。对于大量严重的细胞退化疾病，如糖尿病、脊髓损伤、 心脏病等来说，这种独特的性能为开发新治疗方法提供了可能性。然而，开发这种hESC治疗方法有障碍。此类障碍包括在细胞和组织培养中获得并维持足够量的未分化hESC和控制其分化以产生特定细胞类型。干细胞培养，如hESC细胞培养通常用细胞库或细胞储备物的少量细胞接种，然后在未分化的状态下扩增，直至给定的治疗用途需要分化。为达到这点，目前在含有来源于动物的成分(如滋养层、胎牛血清或MATRIGEL )的表面或培养基存在下培养hESC或其分化细胞。向培养环境添加这些来源于动物的东西使得细胞接触可能有害的病毒或其它传染性物质，这些有害的病毒或其它传染性物质会转移给患者或损害 hESC的常规培养和维持。此外，此类生物产品易产生批次差异、免疫反应，且存储寿命有限。目前为止，尚未发现利用化学成分确定的培养基和合成表面的完全不含动物产品的体系来支持未分化细胞的长期培养。
技术实现思路
在一些实施方式中，本专利技术的合成表面可用于在化学成分确定的培养基存在下， 培养未分化的人胚胎干细胞或其它细胞超过5代。在其它实施方式中，可采用辐射技术，包括Y射线和电子束辐射来对本专利技术的合成表面进行灭菌。在本专利技术的实施方式中，提供了在化学成分确定的培养基中，在通过Y射线灭菌的合成培养表面上培养分离的未分化人胚胎干细胞群的方法。在其它实施方式中，培养分离的未分化人胚胎干细胞可维持存活至少五代。细胞培养制品包括具有表面的基片。在本专利技术的实施方式中，可溶胀(甲基)丙烯酸酯层置于细胞培养基片的表面上。可利用包含甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸2-羧基乙酯和二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯的组合物形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。在其它实施方式中，多肽可偶联到可溶胀丙烯酸酯层。多肽可包含fc^ProGlnValThrArgGlyAspValPheTh rMetPro (SEQ ID NO :1)所示氨基酸序列，其中η是0_3的整数，任何氨基酸。在一些实施方式中，Xagin 可以是 LysGlyGly，(LysGlyGlyProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetP ro(SEQ ID NO :5)。在一些实施方式中，可采用、射线灭菌技术对细胞培养制品进行灭菌。 在其它实施方式中，细胞培养制品可支持在化学成分确定的培养基中培养和维持未分化干细胞，例如人胚胎干细胞。在各种实施方式中，制备细胞培养制品的方法包括将单体置于细胞培养制品的基片表面。置于表面的单体包括丙烯酸2-羧基乙酯、二甲基丙烯酸四(乙二醇)酯和以下的一种甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸2-羟乙酯、1-乙烯基-2-吡咯烷酮、 二(乙二醇)乙醚甲基丙烯酸酯、丙烯酰胺、乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯或3-磺基丙基二甲基-3-甲基丙烯酰胺基丙基铵。该方法还包括在基片表面上聚合单体，以形成可溶胀(甲基)丙烯酸酯层。该方法还包括将包含)CaaGlyGlyProGlnValThrArgGlyAspValPheThrMetP ro(SEQ ID NO :2)所示氨基酸序列的多肽偶联于丙烯酸酯层，其中Xaa可以是任何氨基酸。 在一些实施方式中，Xaa 是 Lys LysGlyGlyAsnGlyGluProArgGlyAspThrTyrArgAlaTyr (SEQ ID NO 6)。与现有技术中的表面相比，本文所述各种实施方式中的一种或多种为培养干细胞，特别是未分化干细胞提供了一个或多个优点。例如，合成表面减少了潜在的污染问题， 而具有获自或衍生自动物来源的组分的表面则与这种污染有关。与含有生物组分的那些表面相比，此类表面提供的储存期也得到改善。本专利技术合成表面的诸多实施方式可经受包括电子束或Y射线在内的辐射灭菌处理。在其它实施方式中，能在化学成分确定的培养基中培养未分化干细胞进一步减少了潜在的污染问题。此外，在合成表面和化学成分确定的培养基中，批次间差异可能较低， 从而改善了培养结果和预期的重现性。结合附图阅读时，从以下详述不难理解这些和其它优点。附图简述附图说明图1显示了本专利技术可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的所选实施方式的平衡水含量。图2显示了具有浓度增加的交联剂的本专利技术可溶胀(甲基)丙烯酸酯层的所选实施方式的平衡水含量。图3A-B是合成可溶胀丙烯酸酯涂层制品的诸多实施方式的侧面示意图。图4A-C是具有孔的细胞培养制品的横截面示意图。无涂层(4A)；涂层表面0B)； 以及涂层表面及侧孔GC)。图5A是6孔板的照片，其用一种实施方式的本专利技术合成可溶胀(甲基)丙烯酸酯涂层涂布。图5B是结晶紫染色的6孔板的两孔的吸收图像，显示了孔中的均勻涂层。图6是辐射灭菌技术对本专利技术涂布表面的不同实施方式的作用。图7A-D是灭菌处理后在各种实施方式的本专利技术涂布表面上生长的细胞的相差图像。图7A和B显示在SAP-BSP表面生长的细胞，图7C和C显示在SAP-VN表面生长的细胞。图8显示细胞在各种实施方式的本专利技术涂布表面上的粘附对剂量的依赖性。图9显示在成分确定的不同培养基存在下，在各种实施方式的本专利技术SAP表面上生长的hESC细胞的AttoPhos荧光。图10显示在不同实施方式的本专利技术SAP表面上生长的hES细胞的AttoWios荧光 (表示为相对于Matrigel对照物的百分比)。图11显示在各种实施方式的本专利技术SAP表面上生长的hES细胞的倍增时间。图12显示在各种实施方式的本专利技术SAP表面上生长的hES细胞的基因表达的流式细胞计测量数据。图13显示与Matrigel 对照表面相比，在各种实施方式的本专利技术SAP表面上生长的hES细胞的荧光图像。图14A-C显示与Matrigel 对照表面相比，在各种实施方式的本专利技术SAP表面上生长的细胞的图像。图3-4所绘附图不一定符合比例。图3-4中所用的相同数字指相同的组分。然而，应该知道，在给定附图中用某数字指示某组分并非限制另一附图中用相同数字标记的组分。此外，利用不同数字指示诸组分并非表示不同编号的组分不能相同或相似。具体实施例方式以下详述中将参考附图，附图构成该详述的一部分，说明了装置、系统和方法的数个具体实施方式。应该理解，在不偏离本专利技术的范围或构思的前提下，也可设想和作出其它实施方式。因此，以下详述并非限制性的。除非另有规定，本文使用的所有科学和技术术语具有本领域常规使用的含义。本文提供的定义有助于理解本文经常使用的某些术语，并不意味着限制本专利技术的范围。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的单数形式“一个”、 “一种”和“该”包括具有复数形式的实施方式。除非文中另有明确表述，本说明书和随附权利要求书中使用的术语“或”通常按其包括“和/或”的意义使用。本文所用的“具有”、“包括”、“包含”等以其开放含义使用，通常表示“包括，但不限于”。术语“水凝胶”已用于描述细胞培养表面。“水凝胶”定义各异，包括吸水量大于或等于其干重的30%或最高10，000%的凝胶或明胶。水凝胶根据水含量分本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种培养分离的未分化干细胞群的方法，包括：提供经辐射灭菌的合成培养表面；在该合成培养表面上提供未分化干细胞；在化学成分确定的培养基中培养该未分化干细胞；以及在化学成分确定的培养基中维持培养未分化干细胞至少五代。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·法捷耶夫，J·格曼，A·W·马丁，Z·梅尔寇米扬，C·B·绍戈本，D·M·韦伯，周悦，
申请(专利权)人：杰龙公司，
类型：发明
国别省市：US
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