用于进行样品和探针单独变性的杂交的组合物和方法技术

本发明专利技术提供用于在杂交应用中单独变性探针和靶标的方法和组合物。本发明专利技术可以例如在杂交应用中不使用甲酰胺或减少对甲酰胺的依赖性。用于本发明专利技术的组合物包括含水组合物，该含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及用于杂交应用的组合物和方法，其涉及靶标和探针的单独变性。在一个实施方案中，本专利技术可以用于DNA和RNA的体内、体外和原位的分子检测。特别是，本专利技术可以在细胞学、组织学和分子生物学领域中用于DNA和RNA分子检测。在其它实施方案中，本专利技术可以用于原位杂交(ISH)应用。
技术介绍
双链核酸分子(即DNA (脱氧核糖核酸)、DNA/RNA (核糖核酸)和RNA/RNA)以双螺旋构型结合。该双螺旋结构由碱基以特定方式(A+T/U或G+C)配对时的相对链上碱基是的氢键结合和堆叠碱基是的疏水键合稳定化。互补碱基配对(杂交)是涉及核酸的所有处理的核心。在杂交的基础实例中，核酸探针或引物经设计与靶标核酸例如样品中的DNA或 RNA结合或“杂交”。一种类型的杂交应用，原位杂交(ISH)，包括与标本中的靶标杂交，其中该标本可以在体内、原位或体外，例如固定或粘附到载玻片上。可以标记探针以使得可能使用荧光或明视野显微镜/扫描仪识别探针-靶杂合体。核酸杂交测定的效率和准确度主要取决于以下3个因素中的至少一个a)变性条件，b)复性条件，和c)杂交后的洗涤条件。为了使探针或引物与样品中的靶标核酸结合，必须分离核酸的互补链。该链分离步骤称为“变性”，通常需要积极条件以破坏双螺旋中的氢键和疏水键。探针和靶标分子可以单独地变性或一起变形(共变性)。已有人提出，单独变性可更好地保持形态学，而共变性可减少实际操作步骤的数目。出于这些理由，单独变性步骤最常用在分子细胞遗传学应用中，且共变性最常用在分析组织切片时。传统的杂交实验，例如ISH测定，使用含甲酰胺的溶液以使双链核酸变性。甲酰胺通过置换松散而均勻结合的水合分子并通过造成Watson-Crick结合位点的“甲酰胺化”来破坏碱基配对。因此，甲酰胺对双链核酸和类似物具有去稳定效应。—旦核酸的互补链已分离，“复性”或“重新退火”步骤就允许引物或探针与样品中的靶标核酸结合。该步骤有时也称为“杂交”步骤。虽然甲酰胺促进双链核酸和类似物的变性，但与不含甲酰胺的含水变性溶液相比，甲酰胺还会显著延长复性时间。事实上，重新退火步骤在传统的杂交应用中是最耗时间的。传统杂交时间的实例见附图说明图1和图2。另外，甲酰胺在长时间处理中具有缺点。甲酰胺是有毒有害物质，其使用和废料都受到严格的法规管制。此外，使用高浓度甲酰胺会导致细胞结构、核结构和/或染色体结构的形态学上的破坏，在检测期间产生高背景信号。因此，存在克服现有技术杂交应用相关缺点的需要。针对该需要，本专利技术提供相比现有技术杂交应用的若干潜在优势
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供方法和组合物，其得出相比现有技术杂交应用具有至少一个下述优势的杂交应用更低的背景、更均勻的背景、样品形态学的保持、更容易的自动化、更快的过程和更安全(较低毒性)的试剂。本专利技术实现这些目的的一种方式是提供用于探针和靶标的单独变性的方法和组合物。本专利技术的组合物和方法适用于任何杂交技术。本专利技术的组合物和方法还适用于使用碱基配对进行杂交或结合的任何分子系统，例如DNA、RNA、PNA、LNA和其合成或天然类似物。本专利技术的核酸杂交方法和组合物可以用于基因组DNA、染色体、染色体片段、基因和染色体畸变的体内、体外或原位分析，例如与正常条件或疾病相关的易位、缺失、扩增、插入、突变或倒位。此外，该方法和组合物有助于检测感染原以及RNA的表达水平变化，例如， mRNA 及其互补 DNA (cDNA)。其它用途包括对下述进行的体内、体外或原位分析信使RNA(mRNA)、病毒RNA、 病毒 DNA、小干扰 RNA(siRNA)、小核 RNA(snRNA)、非编码 RNA(ncRNA，例如 tRNA 和 rRNA)、 转运信使RNA (tmRNA)、微小RNA (miRNA)、PIffI相互作用RNA (piRNA)、长链非编码RNA、 小核RNA(SnoRNA)、反义RNA、双链RNA(dsRNA)，甲基化和其它碱基修饰、单核苷酸多态性 (SNPs)、拷贝数变异(CNVs)，和单独或与未标记核酸组合的用例如放射性同位素、荧光分子、生物素、地高辛(DIG)或抗原标记的核酸。本专利技术的核酸杂交方法和组合物可用于核酸的体内、体外或原位分析，使用例如 RNA印迹(northern blot)、DNA印迹(Southern blot)、流式细胞术、放射自显影、荧光显微镜术、化学发光、免疫组织化学、虚拟核型(virtual karyotype)、基因测定、DNA微阵列(例如阵列比较基因组杂交(阵列CGH))、基因表达谱、基因ID、叠瓦阵列(Tiling array)、凝胶电泳、毛细管电泳和原位杂交例如FISH、SISH、CISH的技术。本专利技术的方法和组合物可用于体外和体内样品例如骨髓涂片、血涂片、石蜡包埋的组织制备物、酶解的组织样品、骨髓、羊水细胞、细胞离心(cytospin)制备物、印迹(imprint)等。在一个实施方案中，本专利技术提供方法和组合物，其用于对分子和靶标使用单独变性步骤，将至少一种分子(例如，探针)与靶标(例如，生物样品)杂交。在其它实施方案中，本专利技术可以不使用甲酰胺，或减少在这种变性步骤中对甲酰胺的依赖性，例如将传统变性缓冲液中70%的甲酰胺降低到本专利技术的组合物和方法中的50%、25 %、15%、10 %、5%、 2%、1%或0% ν/ν的甲酰胺，。因此，在某些方面，本专利技术克服了与传统杂交测定相关的若干缺点，包括与在这种传统杂交测定中使用甲酰胺相关的主要毒性问题和耗时的复性步马聚ο本专利技术的一方面提供用于在杂交应用中单独变性探针和靶标的组合物或溶液。用于变性靶标的组合物可以包括与用于变性探针的组合物相同的成分，或两种组合物可以包括不同成分。本专利技术中使用的组合物可以包括含水组合物，其含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂。足以变性双链核苷酸序列的有效量是允许杂交的量。例如，用于测定极性非质子溶剂的量是否对杂交有效的一种方式是，确定极性非质子溶剂当用在本文所述的杂交方法和组合物中例如实施例1中时是否产生可检测信号和/或扩增的核酸产物。极性非质子溶剂有效量的非限制性实例包括例如约至约95% (ν/ν)。在某些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为5%至60% (ν/ν) 0在其它实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为10%至60% (ν/ν) 0在再一些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度为30%至 50% (ν/ν)。至 5%、5% 至 10%、10%、10% 至 20%、20% 至 30%、30% 至 40%、40% 至 50%、或50%至60%、或60%至70% (ν/ν)的浓度也是合适的。在某些实施方案中，极性非质子溶剂的浓度可以是0. 1%、0. 25%、0. 5%、1%、2%、3%、4%或5% (ν/ν)。在其它实施方案中，极性非质子溶剂的浓度可以是7%、7. 5%,8%,8. 5%,9%,9. 5%U0%U0. 5%, 11%U1. 5%,12%,12. 5%,13%,13. 5%,14%,14. 5%,15%,15. 5%,16%,16. 5%,17%, 17. 5%U8%U8. 5%,19%U9. 5%或 20% (ν/ν)。依据本专利技术的另一方面，含水组合本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种杂交核酸序列的方法，包括：－混合第一核酸序列与第一含水组合物，所述第一含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少一种极性非质子溶剂；－混合第二核酸序列与第二含水组合物，所述第二含水组合物含有足以变性双链核苷酸序列的有效量的至少变性剂；和－混合所述第一核酸序列和所述第二核酸序列，其时间至少足以使所述第一核酸序列和所述第二核酸序列杂交；其中所述极性非质子溶剂不是二甲亚砜（ＤＭＳＯ）。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·H·马希森，
申请(专利权)人：丹麦达科有限公司，
类型：发明
国别省市：DK