转基因动物及其制备方法技术

本发明专利技术提供了一组适于转化细胞的载体、适于转化细胞的载体、制备转基因细胞的方法、非人转基因动物细胞、制备非人转基因动物的方法、非人转基因动物或其后代。根据本发明专利技术的实施例，所述的一组适于转化细胞的载体包括：第一载体，所述第一载体包含附着子序列；以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列。利用这一组适于转化细胞的载体，可以有效地构建无标记的转基因细胞。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
具体地涉及。更具体地涉及一组适于转化细胞的载体、一种适于转化细胞的载体、一种制备转基因细胞的方法、一种非人转基因动物细胞、一种制备非人转基因动物的方法、一种非人转基因动物或其后代。
技术介绍
转基因动物的安全性问题是当前最为重要的社会问题，安全的转基因技术是转基因生物品种安全的重要保障。转基因动植物中的外源基因主要有两大类，即目的基因和标记基因。标记基因是帮助对转基因生物工程体进行筛选和鉴定的一类外源基因，它包括选择标记基因和报告基因。在选择压力下，不含标记基因及其产物的非转化细胞和组织死亡， 而转化细胞由于有抗性，可以继续存活，因而有利于从大量的非转化细胞和组织中选择出转化克隆。在制备转基因动物时，引入标记基因主要是方便转基因阳性材料的筛选。转基因一旦成功后，选择标记基因便不再发挥作用，反而变成了潜在的危险。选择性标记基因引起的最大的争议就是转基因逃逸问题，即导入的标记基因与其野生近缘种等非目标生物间的基因流动，从而有可能破坏整个生态系统；另外一个担忧是选择性标记基因编码产物的毒性，可能影响机体的健康；最后，抗性标记基因以及原核序列还会影响目的基因的表达， 有可能导致表达的沉默。然而，目前的制备转基因动物的方法仍有待改进。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。根据本专利技术的第一方面，本专利技术提出了一组适于转化细胞的载体。根据本专利技术的实施例，所述的一组适于转化细胞的载体包括第一载体，所述第一载体包含附着子序列； 以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列。由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本专利技术的实施例，上述一组适于转化细胞的载体还可以具有下列附加技术特征根据本专利技术的一个实施例，所述附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。根据本专利技术的一个实施例，所述第一载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本专利技术的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本专利技术的一个实施例，所述第一载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列。 由此，可以有效地筛选转入第一载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本专利技术的一些示例，所述筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。根据本专利技术的具体示例，优选所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种。根据本专利技术的具体示例，优选所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本专利技术的一个实施例，所述第二载体进一步包含启动子，所述启动子与所述目的核酸序列可操作地连接。根据本专利技术的一些示例，优选所述启动子为真核细胞启动子。 根据本专利技术的具体示例，更优选所述真核细胞启动子为选自CAG启动子和PGK启动子的至少一种。根据本专利技术的一个具体示例，最优选所述真核细胞启动子为CAG启动子。由此，可以提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。根据本专利技术的一个实施例，所述真核细胞启动子为组织特异性启动子。由此，可以根据宿主细胞的类型，选择适当的启动子，从而获得能够实现目的核酸序列的组织特异性表达。根据本专利技术的一个实施例，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述目的核酸序列可操作地连接。根据本专利技术的一些示例，优选所述增强子为CHS4增强子。由此，可以进一步提高目的核酸序列在宿主细胞中的表达效率。根据本专利技术的一个实施例，所述目的核酸序列的两端分别具有适于同源重组的核酸序列。由此，可以提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率。根据本专利技术的一些示例，优选所述适于同源重组的核酸序列为细胞基因组中的非功能片段。由此，在提高目的核酸序列与宿主细胞染色体发生整合的概率的同时，目的核酸序列的引入并不影响宿主细胞正常基因的表达和功能。根据本专利技术第二方面，本专利技术提出了一种适于转化细胞的载体。根据本专利技术的实施例，该载体包含附着子序列。利用该载体，可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中，而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本专利技术的实施例，上述适于转化细胞的载体还可以具有下列附加技术特征根据本专利技术的一个实施例，所述附着子序列包含编码染色体骨架结合区和/或核基质附着区的核酸序列。由此，利用该附着子序列，可以有效地将目的核酸序列定位于细胞核中，进而有效地促进目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合。根据本专利技术的一个实施例，所述载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列。根据本专利技术的具体示例，优选所述复制起始点为oriP。由此，利用复制起始点，附着子序列可以在宿主细胞内自主复制，从而提高目的核酸序列与宿主细胞的染色体发生整合的概率。根据本专利技术的一个实施例，所述载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列。由此， 可以有效地筛选转入载体的宿主细胞，提高制备转基因细胞的效率。根据本专利技术的一些示例，所述筛选标记为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种。根据本专利技术的具体示例，优选所述发光蛋白为选自GFP和EGFP的至少一种。根据本专利技术的具体示例，优选5所述药物抗性基因为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素B抗性基因的至少一种。由此，可以方便地进行转基因细胞的筛选，进一步提高制备转基因细胞的效率。根据本专利技术的第三方面，本专利技术提出了一种制备转基因细胞的方法。根据本专利技术的实施例，该制备转基因细胞的方法包括以下步骤使用前面所述的一组适于转化细胞的载体转化宿主细胞，以便获得转基因细胞；以及分离转基因细胞，其中所述转基因细胞的染色体中含有所述目的核酸序列。如前所述，由于第一载体和第二载体中分别包含附着子序列和目的核酸序列，因而附着子序列可以促进目的核酸序列整合到宿主细胞的染色体中， 而同时由于附着子序列自身不会与染色体发生整合，因而最终得到的宿主细胞的染色体中不会含有附着子序列，因而最终获得的转基因细胞的基因组中仅仅包含有外来的目的核酸序列，而不存在附着子序列，由此可以有效地构建无标记的转基因细胞。根据本专利技术的实施例，上述制备转基因细胞的方法还可以具有下列附加技术特征根据本专利技术的一个实施例，所述宿主细胞为真核细胞。根据本专利技术的一些示例，优选所述真核细胞为动物细胞，所述动物细胞为来自于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞。本申请的专利技术人惊奇地发现，根据本专利技术的实施例的制备转基因细胞的方法，特别适合于制备真核转基因细胞，尤其是动物细胞。当应用于选自人、牛、羊、猪和兔的至少一种的体细胞时，所得本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一组适于转化细胞的载体，其特征在于，包括：第一载体，所述第一载体包含附着子序列；以及第二载体，所述第二载体包含目的核酸序列，其中，所述附着子序列优选包含编码染色体骨架结合区和／或核基质附着区的核酸序列，更优选包含编码ＥＢＮＡ１和／或核基质附着区的核酸序列，可选地所述染色体骨架结合区是ＥＢＮＡ１；任选地，所述第一载体进一步包括编码复制起始点的核酸序列，所述复制起始点优选为ｏｒｉＰ；任选地，所述第一载体进一步包括编码筛选标记的核酸序列，所述筛选标记优选为选自编码发光蛋白的基因、药物抗性基因的至少一种，所述发光蛋白优选为选自ＧＦＰ和ＥＧＦＰ的至少一种，所述药物抗性基因优选为选自新霉素磷酸转移酶、和潮霉素Ｂ抗性基因的至少一种；任选地，所述第二载体进一步包含启动子，所述启动子与所述目的核酸序列可操作地连接，所述启动子优选为真核细胞启动子，所述真核细胞启动子优选为选自ＣＡＧ启动子和ＰＧＫ启动子的至少一种，可选地所述真核细胞启动子为组织特异性启动子；任选地，所述第二载体进一步包含增强子序列，所述增强子序列与所述目的核酸序列可操作地连接，所述增强子优选为ＣＨＳ４增强子。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，战丽萍，刘欢，杜玉涛，王俊，汪建，杨焕明，
申请(专利权)人：深圳华大基因研究院，深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：94