本发明专利技术公开一种耐凋亡或促凋亡转基因酵母系统，所转基因为survivin基因或survivin第34位突变体，所用载体为组成型质粒pGAPZA或者诱导型质粒pPICZA。本发明专利技术提供的转基因酵母具有与原来不同的生长特性与用途，这既显示了survivin及其突变体在酵母中的作用，可以此作为研究其作用与功能的一个模型，同时又获得了可以通过对毕赤酵母的分子重组与遗传改良，实现降低酵母正常生长的死亡率和凋亡率来提高毕赤酵母的生长密度和速率，从而开发出具有生长活力强、生长周期短、耐凋亡的毕赤酵母表达系统，使其更好地应用于外源蛋白与酶高效生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物分子功能研究、生物制药与酶工程领域，更具体地讲，本专利技术一方面开发了一种研究survivin及其突变体基因作用功能的酵母模型，同时还针对基因工程制药与酶工程等领域用于外源蛋白与酶高效生产的酵母表达生产体系。
技术介绍
基因表达体系是分子生物学及生命科学研究领域的重要内容，也是基因工程药物和疫苗研制等应用领域所必需的重要生物反应器。大肠杆菌(E.coli) —直被用作表达外源基因的宿主菌，并成功地表达了多种外源蛋白，但是，它不能表达结构复杂的蛋白质，且分泌型表达产量较低，而包涵体表达产物的完全复性尚存在诸多问题，在表达产物中还常伴有内毒素成分。哺乳动物细胞、昆虫细胞表达体系虽然能够表达结构复杂的蛋白质，但其操作复杂，培养成本较高，而其表达水平通常较低，特别是在培养过程中多采用加血清培养，不但增加了成本，而且还可能带来动物源性病源微生物污染的风险(如疯牛病朊粒等)， 目前我国在基因工程药物产业化生产中，由于昂贵的造价和技术方面的原因，无血清、大规模悬浮培养动物细胞，尚难于普遍使用。而获得稳定、高效表达生产外源蛋白的转基因动、 植物，不仅操作难度较大，而且成功率又很低。由于历史的原因及酿造工业的发展，人们对酵母的遗传背景和生物学特性研究得较透彻，其表达的产物安全性易被接受。随着生物技术的日新月异的发展，酵母作为真核生物蛋白的表达体系受到广泛的研究和应用，并日趋成熟。酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物的易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有真核生物的蛋白质后加工能力，有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工体系，还能分泌外源蛋白到培养液中，利于纯化。因此，最近二十年来，酵母被认为是一个很有前途的真核表达体系，受到广泛的研究和应用。酿酒酵母(S. cerevisiae)是首先被用来作为外源基因的表达宿主菌，然而， 人们在应用中逐步发现S.cerevisiae表达重组蛋白具有其局限性。甲醇营养型酵母 (Methylotrophic Yeast)表达体系，作为第二代酵母表达体系，它克服了传统酿酒酵母表达体系的诸多缺点和不足，成为国内外广泛而大量生产外源真核或者结构较为复杂的原核蛋白的一个较为理想的、最具有发展前途的表达体系，是实现基因工程疫苗、抗体、酶、激素和毒素等蛋白药物产业化生产的一个重要技术平台。然而，毕赤酵母表达系统在实际应用中也存在一些缺点，其中之一是毕赤酵母发酵表达外源蛋白所用的时间长，这个过程中由于可能有甲醇的毒性和生长条件和环境的因素，使其生长活力下降，这一过程伴随有凋亡现象，而不利于外源蛋白的高效表达。为了解决这一问题，需要从酵母产生凋亡的机制为切入点，分析酵母凋亡机制和凋亡基因，期望通过选择酵母抗凋亡蛋白BirIp的同源物Survivin对毕赤酵母进行分子重组与遗传改良，实现降低酵母正常生长的死亡率和凋亡率来提高毕赤酵母的生长密度和速率，为开发生长活力强、生长周期短，耐凋亡的毕赤酵母奠定基础，使该表达系统更好地应用于外源蛋白与酶高效生产。人Survivin基因定位于17q25，全长约151Λ，该基因有14796个氨基酸，由四个外显子和三个内含子组成。Survivin有两个主要的转录起始位点，位于在起始码ATG前-72 和-57/-61处。RNA全长约1. 9Kb，其中开放读码框架区(ORF)含似9个碱基，可翻译出一个142个氨基酸的蛋白。Survivn基因缺少TATAbox区，其启动子区由一段约250个核苷酸的经典CpG岛，3个细胞周期依赖元件(cell cycle d印endent elememts, CDEs), 1个细胞周期同源区(cell cyclehomology region, CHR)和数个SPl区组成。研究发现正常和肿瘤组织中，Survivin启动子区中的CpG岛多处于非甲基化状态，因此甲基化在Survivin 表达调控中并不起主要作用。当突变掉-171及-151位的SPI序列时，Survivin的转录活性约下降63. 82%。⑶E，CHR区则与Survivin在G2/M期的周期性表达有关。利用含⑶E/ CHR区的Survivin promoter-luciferase重组质粒检测发现，在G2/M期启动子活性比自然生长细胞高5-10倍，而缺少CDE/CHR区则启动子活性不表现周期性变化。Survivin的表达可以抑制由多种刺激如i^as，TNF, VPI6，Taxol等诱导的细胞凋亡。Grossman等利用转基因技术对小鼠皮肤基底层细胞研究发现，Survivin的表达并不影响角化层细胞的分化及增殖，但可以抑制UVB照射引起的细胞凋亡。利用Survivin反义核苷酸阻断Survivin的表达可抑制细胞增殖，使caspase活性增强并导致细胞自发性凋亡。 研究还发现Survivin的突变体如Cys84_Ala及Thr!M-Ala(SurvivinT34A)均可诱导肿瘤细胞发生自发性凋亡，目前对突变体在肿瘤治疗的作用进行研究，而且己取得较好的实验结果。SurvivinT34A的基因序列及其制备方法参见中国专利200510(^6847.8 (授权公告号CN 100424096C)。Survivin的抗凋亡特性在生物进化中是高度保守的，例如果蝇中的凋亡抑制因子Deterin就与Survivin高度同源。但与其它IAP家族成员相比，Survivin抗凋亡能力相对较弱。Survivin的抗凋亡机制目前尚不清楚。IAP家族成员的抗凋亡作用主要通过直接与caspase结合而使其失活。实验表明Survivin可与caspase 9及DIABL0/SMAC结合，因此Survivin有可能通过IAP家族传统的途径抑制细胞凋亡。但Survivin是否能与 easpase-3直接结合目前尚有争论。Siin等用E. coli表达Survivin重组蛋白，发现纯化后的Survivin重组蛋白以同源二聚体形式存在并可与caspase-7及caspase-3直接结合。 Suzuki等则认为Survivin并不与caspase-3直接结合，当受到Fas刺激或细胞增殖时， Survivin可进入胞核并与cdk4结合，促使p21释放，p21可与procaspase-3结合，进而抑制Fas介导的细胞凋亡。此外与其它IAP家族成员相比，Survivn的结构中缺乏位于B^序列上游能与caspase结合的“hook”区。因此Survivin即使能与caspase结合也必定是通过与其它IAP家族成员不同的方式进行。所以survivn的抗凋亡作用是通过IAP家族的途径抑或是通过其他途径进行还需进一步研究来证实。Survivin不仅具有抗凋亡能力，还参与了细胞分裂的调节。Li等研究发现 Survivin具有周期性表达特点，而且其在纺锤体形成中具有重要作用。利用Survivin反义核苷酸进行研究时也发现，阻断Survivin的表达不仅会引起细胞发生自发性凋亡而且还会出现多极纺锤体，多核及胞质分裂失败现象。基因敲除实验则证实了 Survivin在有丝分裂中所起的重要作用。在胚胎期3. 5天时同源敲除Survivin基因会导致微管组装缺陷，纺锤体缺失，形成多核细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种耐凋亡转基因酵母系统，其特征在于，所转基因为ｓｕｒｖｉｖｉｎ基因，所用载体为组成型质粒ｐＧＡＰＺＡ或者诱导型质粒ｐＰＩＣＺＡ。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：马兴元，刘琨，李林凤，姚碧，郑文云，
申请(专利权)人：华东理工大学，
类型：发明
国别省市：31
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