复杂疾病的体外诊断方法技术

本发明专利技术涉及用于在生物样品中体外诊断复杂疾病的方法和试剂盒，所述复杂疾病例如癌症，特别是急性髓细胞白血病(AML)、结肠癌、肾癌、前列腺癌；短暂性脑缺血发作(TIA)，缺血，特别是中风、缺氧、缺氧缺血脑病、围产期脑损伤、新生儿窒息的缺氧缺血脑病；脱髓鞘性病，特别是白质病、脑室周围脑白质病、多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森氏病。对于诊断，测定至少2种不同种类的生物分子并通过适合的分类器算法和其他统计程序将结果分类，从而进行应用。通过本发明专利技术，可实现可靠性(例如仅表达曲线的可靠性)的显著进步。换言之，在确定的集合中，可以实现高达100％准确的阳性诊断，从而使本发明专利技术的方法优于现有技术。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及如权利要求1所述的复杂疾病或其亚型的体外诊断方法，和如权利要求18所述的执行所述方法的试剂盒。在经典患者筛查和诊断中，医务人员利用多种诊断工具对患有某种疾病的患者进行诊断。在这些工具中，对一系列单一常规参数(例如血液样品中的参数)进行测定是常见的诊断实验室方法。这些单一参数包括例如酶活力和酶浓度和/或诸如葡萄糖等代谢指示物的检测。只要涉及到这样的疾病，并且这些疾病可通过临床化学简单地并且毫无疑义地与一种单一参数或若干参数相关联，则这些参数就成为了现代实验室医学和诊断中不可或缺的工具。在能够提供优异的已证实的截断值(cut-off value)的情况下(例如在糖尿病中)，就可以在诊断中可靠地使用临床化学参数例如血糖。特别是，当研究公知病理生理机制背后内在的病理生理状态并从中得出指导性参数时，诸如血液中高葡萄糖浓度通常反映出胰岛素基因的遗传性缺陷，所述单一参数已证实是“其”疾病的可靠生物标志物。然而，在诸如癌症或脱髓鞘性病如多发性硬化症等共性为缺乏明确可指定的单一参数或标志物的病理生理情况下，目前还难以进行由血液样品或组织样品的差别化诊断。在癌症预防、筛查、诊断、治疗和预后治疗中，同时在临床常规上使用一系列均对特定种类癌症在某种程度上有特异性的所谓“肿瘤标志物”来诊断和监测癌病过程的治疗。 目前使用的这种肿瘤标志物例如有α-l-胎蛋白、癌抗原125(CA 125)、癌抗原15_3、CA 50XA 72-4、糖抗原19-9、降钙素、癌胚胎抗原(CEA)、细胞角蛋白片段21_1、粘蛋白样癌相关抗原、神经元特异烯醇化酶、核基质蛋白22、碱性磷酸酶、前列腺特异性抗原(PSA)J-W 细胞癌抗原、端粒酶、胸腺嘧啶激酶、甲状腺球蛋白、和组织多肽抗原。虽然，在现有技术中目前已有多种上述肿瘤标志物常规使用，但极常见的是难以由单一测定实现可靠诊断。仅举一例，CEA的截断值对不吸烟者为4. 6ng/ml，而25%的吸烟者显示在3. 5 lOng/ml的范围的正常值，并且有1 %的吸烟者显示大于lOng/ml的正常值。因此，只有大于20ng/ml的值才被解释为“高度疑似恶性过程”，这留下了很大的灰色区域，在这一区域中医生不能依靠在患者样品中测定的CEA值。EP 540 573 Bl公开了对于前列腺特异性抗原(PSA)的相似的截断值问题，其中通常测定总PSA以诊断或排除患者的前列腺癌，如果该值在灰色区域，则目前的方法是除了测定总PSA外还以对游离PSA特异的单克隆抗体测试测定游离PSA，并计算2个参数的比率从而获得对前列腺癌更准确的诊断方法，并与良性前列腺增生相区分。CEA和PSA检测的上述例子充分表明了所有单一肿瘤标志物共有的情况，即，一方面特异性相对较差，另一方面截断值不确定不可靠，从而难以解读得到的值。因此，一般的结果是，推荐在重要筛查中考虑使用肿瘤标志物。下述情况并不罕见，肿瘤标志物水平增加而没有进一步的临床相关性，使患者丧失勇气，并且根本不具有任何诊断价值。此外，在恶性疾病的预后治疗中，需要注意的是每种肿瘤标志物都首选需要“临界量”的癌细胞，直到其在临床测试中有阳性响应。另外，不是所有复发肿瘤都必须涉及肿瘤标志物水平的增加。总之，大多数情况中只有在结合其他诊断工具如内窥镜和活检以及随后的组织学检验的情况下，单一肿瘤标志物才被证实在临床实践中有用，但在常规癌症筛查中是不可靠的。对于单一肿瘤标志物的现有技术，一个巨大的进步是使用了利用微阵列技术的多基因表达水平。例如WO 2004111197A2，公开了用于获得气道上皮细胞RNA的侵袭性最小的样品获取方法，可通过表达谱(例如通过基于阵列的基因表达谱)来对所述RNA进行分析。这些方法可用于鉴定诊断肺病如肺癌的基因表达模式，从而识别有发展肺病的风险的受试者和定制开发用于诊断或预测肺病或肺病易感性的阵列，例如微阵列。出于这一目的，还公开了阵列和有信息的基因。这种多基因方法比上述单一参数要可靠得多，但受限于复杂的数学和生物信息学程序。尽管如此，这些基因表达标记是有前途的癌症诊断工具，但有时也具有不确定的限制，这些限制由于其内在统计学和受到一种核酸的限制有时也会导致不可靠的结果和确认问题。
技术实现思路
从上述现有技术出发，本专利技术的问题是提供一种生物标志物在诊断工具中的应用，上述诊断工具对于早期诊断以确定患病受试者具有最高可能的灵敏度和特异性，上述诊断工具用于患者预选和分组和用于治疗控制是诊断开发中的主要目标，并且还是各种复杂疾病特别是癌症的紧急需要。上述问题通过如权利要求1所述的方法和如权利要求18所述的试剂盒得以解决。特别是，本专利技术提供了在哺乳动物受试者的至少一个组织的至少一个生物样品中的复杂疾病或其亚型的体外诊断方法，所述复杂疾病或其亚型选自癌症，特别是急性髓细胞白血病(AML)、结肠癌、肾癌、前列腺癌；缺血，特别是中风、缺氧、缺氧缺血脑病、围产期脑损伤、新生儿窒息的缺氧缺血脑病；脱髓鞘性病，特别是白质病、脑室周围脑白质病、多发性硬化症；所述方法包括以下步骤a)选择至少2个不同种类的生物分子，其中所述种类的生物分子选自RNA和/或其DNA对应物、微小RNA和/或其DNA对应物、肽、蛋白质、和代谢物；b)利用至少2组不同种类的生物分子测定所述样品中的每一种类的多种生物分子的选自是否存在(阳性或阴性)、定性和/或定量分子模式和/或分子标记、水平、量、浓度和表达水平的至少一种参数，并将所获得的值的组作为原始数据存储于数据库中；c)对所述原始数据进行数学预处理从而减少步骤b)中所用测定程序固有的技术误差；d)从逻辑回归、(对角线)线性或二次判别分析(LDA、QDA、DLDA、DQDA)、感知器、 缩小矩心正规判别分析(RDA)、随机森林(RF)、神经网络(NN)、贝叶斯网络、隐马模型、支持向量机(SVM)、偏一般最小平方法(GPLS)、围绕中心点划分(PAM)、自组织映射(SOM)、递归拆分和回归树、K-最邻近分类法(K-NN)、模糊分类器、袋翻、增压、和na'iveBayes中选择至少一种适合的分类算法；并将所述选择的分类器算法用于步骤c)的所述预处理的数据；e)将步骤d)的所述分类器算法对至少一个训练数据组进行训练，所述至少一个训练数据组包含来自根据其病理生理、生理、预测、或响应者情况分类的受试者的预处理数据，从而选择一个分类器功能从而将所述预处理数据映射至所述情况；f)将步骤e)的所述经训练的分类器算法应用于病理生理、生理、预测、或响应者情况未知的受试者的预处理数据组，并使用所述经训练的分类器算法预测所述数据组的类别标签从而诊断所述受试者的病况。从属权利要求2 18是本专利技术的优选实施方式。本专利技术提供了上述问题的解决方案，并一般性涉及应用“组学”数据(包括但不限于mRNA表达数据、微小RNA表达数据、蛋白质组学数据、和代谢组学数据)，统计学习和机器学习分别用于识别分子标记和生物标志物。其包括经由已知方法测定上述生物分子的浓度，已知方法例如聚合酶链式反应(PCR)、微阵列和其他方法如测序以测定RNA浓度、通过质谱(MS)、特别是MS-技术如MALDI、ESI、大气压化学电离(APCI)和其他方法对蛋白识别和定量，利用MS-技术或替代性方法测定代谢物浓度，后续本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种哺乳动物受试者的至少一个组织的至少一个生物样品中的复杂疾病或其亚型的体外诊断方法，所述复杂疾病或其亚型选自：癌症，特别是急性髓细胞白血病（ＡＭＬ）、结肠癌、肾癌、前列腺癌；短暂性脑缺血发作（ＴＩＡ），缺血，特别是中风、缺氧、缺氧缺血脑病、围产期脑损伤、新生儿窒息的缺氧缺血脑病；脱髓鞘性病，特别是白质病、脑室周围脑白质病、多发性硬化症、阿尔茨海默病和帕金森氏病；所述方法包括以下步骤：ａ）选择至少２个不同种类的生物分子，其中所述种类的生物分子选自：ＲＮＡ和／或其ＤＮＡ对应物、微小ＲＮＡ和／或其ＤＮＡ对应物、肽、蛋白质、和代谢物；ｂ）利用至少２组不同种类的生物分子测定所述样品中的每一种类的多个生物分子的选自存在或不存在、定性和／或定量分子模式和／或分子标记、水平、量、浓度和表达水平的至少一种参数，并将所获得的值的组作为原始数据存储于数据库中；ｃ）对所述原始数据进行数学预处理从而减少步骤ｂ）中所用测定程序固有的技术误差；ｄ）从逻辑回归、（对角线）线性或二次判别分析（ＬＤＡ、ＱＤＡ、ＤＬＤＡ、ＤＱＤＡ）、感知器、缩小矩心正规判别分析（ＲＤＡ）、随机森林（ＲＦ）、神经网络（ＮＮ）、贝叶斯网络、隐马模型、支持向量机（ＳＶＭ）、偏一般最小平方法（ＧＰＬＳ）、围绕中心点划分（ＰＡＭ）、自组织映射（ＳＯＭ）、递归拆分和回归树、Ｋ－最邻近分类法（Ｋ－ＮＮ）、模糊分类器、袋翻、增压、和Ｂａｙｅｓ中选择至少一种适合的分类算法；并将所述选择的分类器算法用于步骤ｃ）的所述预处理的数据；ｅ）将步骤ｄ）的所述分类器算法对至少一个训练数据组进行训练，所述训练数据组包含来自根据其病理生理、生理、预后、或响应者情况分类的受试者的预处理数据，从而选择一个分类器功能从而将所述预处理数据映射至所述情况；ｆ）将步骤ｅ）的所述经训练的分类器算法应用于病理生理、生理、预后、或响应者情况未知的受试者的预处理数据组，并使用所述经训练的分类器算法预测所述数据组的类别标签从而诊断所述受试者的病况。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·迭戈那，M·科尔，M·科勒，T·克尔，K·温伯格，
申请(专利权)人：拜奥尼茨生命科学公司，
类型：发明
国别省市：AT