本发明专利技术提供了改进型蛋白酶，所述改进型蛋白酶含有与SEQ?ID?NO：3具有至少75％一致性的氨基酸序列，所述改进型蛋白酶具有至少一种突变，所述突变选自由下述突变组成的组：(A)利用酸性氨基酸替换对应于SEQ?ID?NO：3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺；和(B)利用酸性氨基酸替换SEQ?ID?NO：3中266位的谷氨酰胺；其中，所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及来自于微生物的蛋白酶，所述蛋白酶具有改进的凝乳活性。所述蛋白酶优选用于奶酪的生产。
技术介绍
小牛粗制凝乳酶(calf rennet)已经作为可凝乳的酶(milk-clotting enzyme) 被用于生产奶酪许多年。小牛粗制凝乳酶的凝乳活性主要归功于凝乳酶(chymosin)，该凝乳酶为酸性蛋白酶，对乳酪蛋白(milk casein)具有位点特异性的蛋白酶活性，同时具有较低的位点非特异性活性(特异性地水解κ-酪蛋白氨基酸序列中105位的苯丙氨酸和106 位的甲硫氨酸之间的肽键)。非特异性蛋白酶活性被认为导致奶酪生产的产率降低并在成熟过程中生成苦味的肽。由于这个原因，凝乳酶是一种出色的可凝乳的酶。然而，小牛屠宰的减少和奶酪需求的增加使得很难提供所述小牛粗制凝乳酶。 现今，来自微生物(如米黑根毛霉(Rhizomucor miehei)和微小根毛霉(Rhizomucor pusillus))的可凝乳的酶以及通过将小牛凝乳酶基因导入真菌或酵母生产的重组凝乳酶已被广泛用作可凝乳的酶。与小牛凝乳酶或重组凝乳酶相比，上述来自微生物的可凝乳的酶具有更高的非特异性蛋白酶活性。问题是作为可凝乳的酶的重要特征的C/P比(凝乳活性与蛋白酶活性的比)低。为克服这一缺陷，在微小根毛霉中表达和评价通过基因工程的定点突变得到的所述可凝乳的酶的变体基因。在该变体中，通过用丙氨酸替换所述可凝乳的酶的氨基酸序列中19位的谷氨酸，与野生型的C/P比相比，其C/P比有所提高(非专利文件1)。然而，进行所述氨基酸替换后，所述可凝乳的酶变体的凝乳活性降低了约40%，所以很难将这样的酶投入实际应用。因此，期望能得到来自于微生物的、具有高C/P比且凝乳活性得以维持或提高的可凝乳的酶。此外，已经尝试了利用二羧酸酐对来自于微生物(如微小根毛霉和米黑根毛霉) 的可凝乳的酶进行酰化以提高C/P比(专利文件1)。根据这一方法，得到了一些改进，然而，这些仍然无法令人满意。日本专利No. 2-18834BJ. Biochem. 129，791-794，200
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种适合于凝乳的蛋白酶，其中，所述蛋白酶水解除 κ -酪蛋白的氨基酸序列中105位的苯丙氨酸和106位的甲硫氨酸之间的肽键以外的肽键的活性(下文中还称为“非特异性蛋白酶活性”)很低，并且凝乳活性得以维持或提高。本专利技术的专利技术人等进行了深入的研究以克服上述问题，在生产可凝乳的酶的微生物的突变株中分离得到了生产C/P比提高的可凝乳的酶的突变株，所述C/P比的提高是由于非特异性蛋白酶活性的降低；分离得到了改进型可凝乳的酶的基因；测定了所述基因的核苷酸序列；表达了该基因；并测定了所述改进型可凝乳的酶的凝乳活性和C/P比，从而完成了本专利技术。因此，本专利技术提供了一种来自于微生物的具有凝乳活性的蛋白酶，所述蛋白酶的凝乳活性得以维持或提高并且C/P比提高；本专利技术还提供了编码该蛋白酶的DNA、包含该 DNA的载体和导入该载体的转化细胞。本专利技术一方面在于提供一种改进型蛋白酶，所述改进型蛋白酶含有与SEQ ID NO 3具有至少75% —致性的氨基酸序列。所述改进型蛋白酶具有至少一种突变，所述突变选自由下述突变组成的组(A)利用酸性氨基酸替换对应于SEQ ID NO 3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺； 和(B)利用酸性氨基酸替换SEQ ID NO :3中266位的谷氨酰胺；其中，所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。本专利技术另一方面在于提供上述的改进型蛋白酶，该蛋白酶选自由下述蛋白质组成的组(A)包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替换；(B)包含SEQ ID NO :3或SEQ ID NO 43的氨基酸序列的蛋白，只是265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替换，以及除265位和266位的氨基酸以外，还有不多于10个氨基酸(优选不多于5个氨基酸，更优选不多于3个氨基酸，进一步优选不多于2个氨基酸)被取代、缺失、插入或添加；其中，所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。本专利技术又一方面在于提供上述的改进型蛋白酶，其中所述酸性氨基酸为谷氨酸或天冬氨酸。本专利技术又一方面在于提供上述的改进型蛋白酶，其中19位的谷氨酸被缬氨酸、丙氨酸、异亮氨酸或亮氨酸替换。本专利技术又一方面在于提供上述的改进型蛋白酶，其中81位的苏氨酸被谷氨酰胺或天冬氨酸替换。本专利技术还有一方面在于提供编码上述改进型蛋白酶的DNA。本专利技术还有一方面在于提供包含上述DNA的表达载体。本专利技术还有一方面在于提供导入上述表达载体的转化细胞。本专利技术还有一方面在于提供上述的转化细胞，所述转化细胞为酿酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae)0本专利技术还有一方面在于提供生产具有凝乳活性的改进型蛋白酶的方法，该方法包含如下步骤在培养基中培养上述转化细胞；以及收集所述培养基中的所述改进型蛋白酶。因为凝乳活性得以维持或提高并且C/P比高，期望利用本专利技术的改进型酶实现较高的奶酪生产率。此外，较高的C/P比通常意味着成熟过程中在奶酪里出现的苦味减少， 即，利用所述改进的酶可制造出高品质的奶酪。附图说明图1示出表达载体JS4的结构。图2示出来自于微小根毛霉的蛋白酶(RMPP)与来自于米黑根毛霉的蛋白酶 (RMMP)的序列比对。具体实施例方式下文将详细阐述本专利技术。1.本专利技术的改进型蛋白酶(可凝乳的酶)本专利技术的改进型蛋白酶含有与SEQ ID NO 3具有至少75% —致性的氨基酸序列， 该蛋白酶具有至少一种突变，所述突变选自由下述突变组成的组(A)利用酸性氨基酸替换对应于SEQ ID NO 3中265位的谷氨酰胺的谷氨酰胺； 和(B)利用酸性氨基酸替换SEQ ID NO :3中266位的谷氨酰胺；并且所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。上述酸性氨基酸的实例包括谷氨酸和天冬氨酸。本专利技术的改进型蛋白酶优选与SEQ ID NO 3的完整氨基酸序列的序列一致性不低于90%，更优选不低于95%。在一个实施方式中，通过将突变引入来自于米黑根毛霉的野生型蛋白酶(SEQ ID NO 3)中而得到本专利技术的改进型蛋白酶。在该实施方式中，本专利技术的改进型蛋白酶选自由下述蛋白质组成的组(A)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和/ 或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替换；(B)包含SEQ ID NO 3的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和 /或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替换，以及除265位和266位的氨基酸以外，还有不多于10个氨基酸被取代、缺失、插入或添加；并且所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。图2示出来自于米黑根毛霉的蛋白酶与来自于微小根毛霉的蛋白酶的序列比对。 在这两个序列中，265位和266位的氨基酸是保守的，所以也可通过将突变引入来自于微小根毛霉的野生型蛋白酶(SEQ ID NO 43)中而得到本专利技术的改进型蛋白酶。即，在另一个实施方式中，本专利技术的改进型蛋白酶可以是包含SEQ ID NO :43的氨基酸序列的蛋白，只是所述蛋白265位的谷氨酰胺和/或266位的谷氨酰胺被酸性氨基酸替换。另外，只要具有凝乳活性，除265本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种改进型蛋白酶，所述改进型蛋白酶含有与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３具有至少７５％一致性的氨基酸序列，所述改进型蛋白酶具有至少一种突变，所述突变选自由下述突变组成的组：（Ａ）利用酸性氨基酸替换对应于ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中２６５位的谷氨酰胺的谷氨酰胺；和（Ｂ）利用酸性氨基酸替换ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３中２６６位的谷氨酰胺；其中，所述改进型蛋白酶具有凝乳活性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：原田和德，小林弘幸，须贺太郎，山口大志，角田昭，加藤重昭，
申请(专利权)人：名糖产业株式会社，
类型：发明
国别省市：JP
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