抗老年性痴呆的单克隆抗体及其应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药领域。本发明专利技术提供了一种抗老年性痴呆抗体及其序列和制备方法。实验证明所述抗体能够特异性检测老年性痴呆，并能显著促进小胶质细胞对纤维和斑块的吞噬，因此本发明专利技术所述抗体能够用于老年性痴呆的早期诊断和治疗。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域。本专利技术涉及用于早期检测和治疗老年性痴呆 (Alzheimer’sDisease，AD)的抗体。具体而言，本专利技术涉及抗老年痴呆症主要靶蛋白A β 42 肽的单克隆抗体及其应用。
技术介绍
老年性痴呆(Alzheimer’ s Disease. AD)是一种渐进性神经退化性疾病，其主要表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，同时伴有各种神经症状和行为障碍，具有非常高的发病率。自1907年德国医生Alois Alzheimer首次报道AD的症状和病理至今已近一个世纪，AD的确切致病机理仍无定论。研究发现，AD的主要病理表现有脑内细胞外的老年斑(senile plaques)沉积、细胞内的神经原纤维缠结(neurofibrillary tangles, NFT)以及胆碱功能缺损等，最终造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。1984年，Glenner和Wong(Biochem Biophys Res Commun, 1984,120 (3) =885-890)发现老年斑的主要成分是一种由39至43个氨基酸残基组成的具有折叠构型的多肽，相对分子质量约4200，称为β-淀粉样蛋白(i3-amyloid，A β)。1992 年，Hardy 和 Higgins Science，1992,256(5054) 184-185)提出了 “Α β 级联假说(amyloid cascade hypothesis) ”，认为A β的聚集和沉积能加剧神经原纤维的缠结， 并导致细胞死亡，是AD形成的最主要原因。A β沉积发生在AD早期，且与正常大脑相比， AD患者大脑中的Αβ沉积更为严重和广泛，而A β本身能引起氧化应激、细胞凋亡以及轴突生长异常等神经病理学变化，提示A β在AD的产生与发展中具有重要作用。A β沉积主要集中在小胶质细胞周围，并刺激小胶质细胞释放炎症因子，发生炎症反应，这种慢性炎症反应能够引起细胞的裂解并释放具有反应活性的氧化性物质，从而削弱了吞噬细胞的吞噬作用，这样更加剧了 A β的沉积。A β蛋白在大脑内积聚形成纤维和斑块(俗称老年斑)，造成神经元损伤和坏死并最终导致海绵脑病。A β是淀粉样前体蛋白(amyloid precursor protein,APP)正常代谢的产物之一。APP基因位于人类第21号染色体长臂，由至少18个外显子编码，A β的编码序列位于第16、17个外显子。APP主要有两条代谢途径一是α -分泌酶在687与688氨基酸之间切割，将APP氨基末端671个氨基酸的可溶性多肽sAPP α释放到胞外，由于切割位点在A β序列内，因此不产生完整的A β片段；另一条途径是经β-分泌酶在671与672 氨基酸之间切割，然后由g_分泌酶在APP的跨膜区切割，释放出A β 40、Α β 42、Α β 43，正常情况下多数为Αβ 40(90% )，只有少量Αβ42和Αβ43产生。Wiltfang等(2007，Journal ofNeurochemistry,101(4) :1053-1059)发现，A β40 肽和 A β 42 肽的比例失调，是造成老年痴呆的重要原因之一。因此A β 42肽成为研究人员治疗AD的重要靶点。APP的代谢和A β的产生受到多种因素的调节。对早期发病AD的遗传学研究发现，大部分AD与第21号染色体上的APP基因突变相关，为揭示A β和APP在AD病理发展中的作用提供了强有力的证据。AD突变位于APP的第670和671密码子，能增强β -分泌酶的活性。突变位于APP的第612个密码子，能抑制α-分泌酶的剪切活性。这两种突变的结果使更多的APP由β -分泌酶途径代谢，产生大量的A β。经细胞产生并释放至胞外的A β将在适当的条件下聚集。A β的聚集主要有两个步骤，即核心形成和聚集体扩大。核心形成是A β聚集过程中的限速步骤。A β 1-42 具有较强的自我聚集能力，是核心的主要成分。因此，A β 42肽是治疗老年痴呆症的主要靶点。A β的毒性主要表现在(1)Α β能与细胞表面的许多受体结合，如神经NGF的低亲和力受体Ρ75、高级糖基化终产物的受体，从而激活胞内的caspase信号通路，诱导神经元凋亡。A β还能改变线粒体膜的通透性，导致细胞色素c由线粒体释放到胞浆并与凋亡蛋白酶激活因子结合，参与激活caspase通路，引起细胞凋亡。(2)A β的毒性一部分是通过小胶质细胞之类的非神经元细胞来介导，在神经斑周围通常能够发现被激活的小胶质细胞。胶质细胞的活化导致白介素-I(IL-I)的过度表达和释放，继而诱发IL-6、肿瘤坏死因子-α (TNF-α)、γ-干扰素(INF-γ )等细胞因子的表达，还能诱导补体、黏附分子、急性期蛋白、氧自由基、前列腺素、一氧化氮等生成增加，这些分子通过作用于胶质细胞或神经元， 促使其他炎症分子的产生，这种交互作用促成了慢性炎症产物分别在AD病理损伤的不同阶段起作用，并贯穿其病理发展的全过程。(3)3、Αβ能降低Na+和Κ+-ΑΤΡ酶的活性，从而改变膜的极性和流动性，并通过干扰L-型电压依赖性的Ca2+通道来破坏细胞内钙的动态平衡。另外，A β能引起蛋白质过氧化和脂质过氧化，破坏超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)，从而降低细胞抵御氧化应激的能力。(4) AD患者脑中的能量代谢变化早于老年斑等主要病理表现的产生。试验发现A β不仅能破坏线粒体膜，还能直接作用于线粒体内的三羧酸循环和电子传递链，减少ATP的产生。能量代谢的损伤将进一步诱导氧自由基和钙超载，三者之间相互影响而形成恶性循环，最终导致包括AD在内的神经退行性疾病。(5)A β可以作用于兴奋性氨基酸受体-NMDA(N-methyl-D-aSpartiate)受体，增加该受体对兴奋性氨基酸，如谷氨酸的敏感性，导致带有该受体的神经元被内源性谷氨酸损害。由于机体自身存在有效的清除机制，A β的产生和清除在生理条件下能保持动态平衡；而在AD病理过程中，A β的产生和清除之间失去平衡。近年来人们开始认识到迟发性AD与脑内A β的清除减少密切相关。脑内A β的清除主要包括细胞外降解、细胞内吞和转运清除。(1)细胞外降解。A β的降解有多种酶的参与，它们在A β的不同位点发挥作用，不同脑区(皮质和海马)和不同状态(可溶性或不溶性、单体或寡聚体)的A β由不同的酶降解，任何一种降解酶的功能障碍都有可能成为引发AD的危险因素。(2)细胞内吞。A β的细胞内吞由低密度脂蛋白受体相关蛋白(low-density lipoprotein receptor related protein, LRP)和清道夫受体(scavenger receptor, SR)介导。LRP 介导可溶性 Αβ复合物的内吞，SR介导小胶质细胞对纤维化Αβ的内吞。随年龄增长，LRP的表达呈现进行性下降，在AD患者尤其明显。(3)转运清除。脑内A β的转运清除包括血脑屏障转运和经非特异性脑间质液泵流到脑脊液后进入血流而清除。脑内绝大多数的A β是经血脑屏障转运出脑，10%-15%的A β由脑间质液泵流清除。这两种方式都与LRP有关，LRP 基因缺失后动物脑内A β成倍增加。由于认识到A 本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于检测老年性痴呆的试剂，其中包括作为活性成分的单克隆抗体，所述单克隆抗体：（ａ）重链可变区包括ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示氨基酸序列；（ｂ）轻链可变区包括ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示氨基酸序列；（ｃ）重链可变区包括ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示氨基酸序列，且轻链可变区包括ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示氨基酸序列；（ｄ）重链可变区与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：３所示氨基酸序列具有至少９０％同一性；或（ｅ）轻链可变区与ＳＥＱ　ＩＤ　ＮＯ：４所示氨基酸序列具有至少９０％同一性。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：叶庆炜，
申请(专利权)人：徐州逸仕生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：32