本发明专利技术提供一种人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶免疫原性肽段及其用途。所述肽段由人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸连续12个氨基酸构成，肽段氨基酸序列为：Glu-Glu-Val-Phe-Lys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu。通过免疫学方法制备针对上述肽段的抗体可以作为人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂，该抗体可用于调节人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶促凝功能的研究。基于上述肽段制备的单克隆抗体将有助于微循环障碍疾病的临床干预。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶免疫原性肽段NPG-12和应用该肽段制备的抗体，以及该抗体作为人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶特异性抑制剂的应用。
技术介绍
人源性纤维蛋白原样蛋白2凝血酶原酶(Human Fibrinogen-Iike Protein 2Prothrombinase, fgl2凝血酶原酶)介导的凝血途径的激活在许多微循环障碍疾病中扮演着重要角色。与传统内源性和外源性凝血途径不同，它不依赖fe因子而从“旁路”直接催化凝血酶原转变成有活性的凝血酶，从而快速启动凝血反应导致微血管内原位血栓形成。 大量的研究证实，在细菌和病毒感染性疾病(如内毒素休克，病毒性肝炎)、肾小球肾炎、癌症、同种或异种器官移植排斥反应、自发性流产、心肌缺血再灌注损伤病理模型中均发现新的促凝剂——fgl2凝血酶原酶异常高表达于微血管内皮，fgl2凝血酶原酶的激活可导致广泛的“纤维蛋白性”微血栓，从而导致组织和器官坏死。因此，fgl2凝血酶原酶成为微循环障碍性疾病新的干预靶点。hfgl2凝血酶原酶基因位于人7号染色体长臂第1区第1条带的第23个亚带，英文简写为7qll. 23。该hfgl2凝血酶原酶是丝氨酸蛋白酶，由439个氨基酸组成的一种II 型跨膜蛋白，有2个氨基酸的胞浆结构域、21个氨基酸的跨膜结构域和416个氨基酸的胞外结构域；现已证实hfgl2凝血酶原酶表达于内皮细胞、巨噬细胞、THP-I细胞、T淋巴细胞等细胞膜上。研究表明，表达于膜上的hfgl2凝血酶原酶具有较强的促凝活性。分析hfgl2凝血酶原酶蛋白质结构表明，其胞外结构域羧基端与纤维蛋白原的β和Y链有高度同源性， 该结构域被称为hfgl2凝血酶原酶纤维蛋白原相关结构域(Fibrinogen related domain, FRED片段)，具有免疫调节作用，但不是促凝活性的关键部位；而位于胞外氨基端91位丝氨酸残基是hfgl2促凝血活性结构域的关键位点，具有丝氨酸蛋白酶生物学活性。目前制备的针对hfgl2凝血酶原酶FRED片段抗体虽能抑制hfgl2凝血酶原酶的促凝活性，然而由于FRED片段与纤维蛋白原的β和γ链有高度同源性，许多研究已证实纤维蛋白原超家族有免疫调节作用，因此该抗体既在抑制hfgl2凝血酶原酶促凝活性的同时也影响免疫调节作用。再者，hfgl2凝血酶原酶促凝活性的关键位点是胞外氨基端91位丝氨酸残基，且抗hfgl2凝血酶原酶FRED片段抗体因内源性交叉反应可能会影响纤维蛋白原的免疫调功能。目前尚无针对hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸肽段的特异性抑制剂，也缺乏针对原位微血栓治疗的市售的特异性药物。若能通过生物学手段，制备针对hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸连续肽段的抗体，理论上则可特异地抑制hfgl2凝血酶原酶的促凝活性，抑制原位微血栓的形成， 且不影响人体免疫调节和纤维蛋白原的生理功能。目前尚未见抗hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的免疫原性肽段NPG-12及其抗体的相关报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的免疫原性肽段NPG-12，通过免疫学的方法制备针对该肽段的特异性抗体 Anti-NPG-12抗体，基于该肽段制备的抗体，可以作为hfgl2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂。实现本专利技术的具体技术方案(1) hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端NPG-12的选择本专利技术的设计人从hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近筛选出富含谷氨酸肽段NPG-12，作为抗原决定簇或半抗原。具体氨基酸序列为=Glu-Glu-Val-Phe-L ys-Glu-Val-Gln-Asn-Leu-Lys-Glu,并应用该肽段作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体。0)NPG-12 的合成根据NPG-12氨基酸序列采用FMOC固相合成法，应用PSSM-8多肽自动合成仪合成。(3) Anti-NPG-12 抗体的制备采用戊二醛偶联法，以牛血清白蛋白作为载体蛋白合成NPG-12-BSA完全抗原。将此抗原与完全或不完全弗氏佐剂免疫新西兰大白兔，制备Anti-NPG-12抗体。定期测定血清中该抗体的滴度。于免疫5次后取血，亲合层析法提纯该抗体。(4)表达hfgl2凝血酶原酶细胞模型的建立采用20ng/ml IFN-γ刺激人急性单核细胞白血病细胞株ΤΗΡ-1细胞12小时，细胞可表达hfgl2凝血酶原酶。(5) Anti-NPG-12抗体的特异性鉴定通过间接酶联免疫吸附试验，检测新西兰大白兔血清中Anti-NPG-12抗体的滴度。通过免疫荧光组织化学法，检测Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激的THP-I表达 hfgl2凝血酶原酶的结合。通过免疫印迹法，检测Anti-NPG-12抗体与受IFN- γ刺激的THP-I表达hfgl2凝血酶原酶的结合。(6) Anti-NPG-12抗体对hfgl2凝血酶原酶凝血活性的影响通过单向凝集试验(one stage clotting assay)，检测Anti-NPG-12抗体对表达 hfgl2凝血酶原酶的人急性单核细胞白血病THP-I细胞株促凝活性的抑制作用。(7) Anti-NPG-12抗体对健康人血浆PT和APTT的影响通过对血浆凝血酶原酶时间(Prothrombin Time, PT)测定，检测Anti_NPG_12抗体对健康者血浆PT的影响。ffl yg ^ ΜIfiI yg Bl fs] (Activated partial thromboplastin time, APTT)测定，检测Anti-NPG-12抗体对健康者血浆APTT的影响。本专利技术提供的肽段的有益效果(DNPG-12可作为抗原决定簇/半抗原制备针对该肽段的抗体，该肽段也可用作检测、筛选和鉴定对hfgl2凝血酶原酶具有抑制功能的抗体所针对的抗原决定簇。(2)基于hfgl2凝血酶原酶胞外氨基端91位丝氨酸残基附近富含谷氨酸肽段 NPG-12制备的抗体——Anti-NPG-12抗体可作为hfgl2凝血酶原酶新的、特异性抑制剂，用于对hfgl2凝血酶原酶功能的研究。基于NPG-12肽段所制备的单克隆抗体将有助于抑制微循环原位血栓的形成。附图说明图1 :hfgl2凝血酶原酶预测图。A :hfgl2凝血酶原酶氨基酸的亲水性预测图，黑线表示所取肽段NPG-12 ；B :hfgl2凝血酶原酶氨基酸抗原指数预测图，黑线表示所取的肽段NPG-12 ；C :hfgl2凝血酶原酶氨基酸柔韧性预测图，黑线表示所取肽段NPG-12。图2 Anti-NPG-12抗体滴度。第一次免疫后2周，抗体滴度为1 3200 ；第二次免疫后2周，抗体滴度为1 25600 ；第三次免疫后2周，抗体滴度为1 51200 ；第四次免疫后2周，抗体滴度为1 51200 ；第五次免疫后1周抗体滴度为1 40000。图3 Anti-NPG-12抗体与hfgl2凝血酶原酶的结合免疫荧光结果显示A =Anti-NBG-12抗体3 μ g/ml)与未受IFN-γ刺激的 THP-I细胞膜表达蛋白的结合，Al :a本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一种人源性纤维蛋白原样蛋白２免疫原性肽段，该肽段由人源性纤维蛋白原样蛋白２凝血酶原酶胞外氨基端９１位丝氨酸残基附近富含谷氨酸的连续的１２个氨基酸构成。其特征在于：所述肽段的氨基酸序列为：Ｇｌｕ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ－Ｖａｌ－Ｇｌｎ－Ａｓｎ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－Ｇｌｕ，应用该肽段作为抗原决定簇／半抗原制备针对该肽段的抗体。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王朝晖，刘坤，李文珠，苏冠华，陈宇，王敏，王珏，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：83
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