诊断过敏性反应的方法技术

本发明专利技术提供了一种单一细胞中多重细胞因子检测方法，其目的是产生疾病的免疫曲线。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术提供了从单一细胞中检测多重细胞因子和相关表面表达的免疫生物标志物的方法，目的是产生疾病的免疫学曲线。
技术介绍
本领域已知单个细胞，即使外观一致，其许多特征也是不同的，例如，在表达特定基因方面的差异、关键细胞代谢物或者关键离子浓度的差异、或者对给定刺激反应方式的差异。活细胞对许多细胞成分具有非常低的拷贝数，所述细胞成分包括脱氧核糖核酸(DNA) 和重要的调节分子。基因表达的生化过程所固有的随机事件(固有噪音)和在其他细胞成分中的不稳定性(外在噪音)基本上促进了细胞中的全部变化。细胞型、突变和不稳定性促进了人体内细胞的多样性。但是，大多数临床试验或者基于细胞的实验分析大量的细胞，使用血清或者细胞培养媒介物。这些实验通常将来自整个细胞群的信息平均化，且不提供更为详细的信息，而这些更为详细的信息对评价生物系统的状态是至关重要的，例如，1)在同样的细胞中，或者在该细胞不同的子群中，两种或者更多种基因是否共表达；2)测量到的总体表达量的小幅增加是由全体细胞小幅、均一的增加引起的，还是由某一细胞子集的大幅增加引起的。
技术实现思路
在纳米规模或者亚纳米规模的实验系统中，本专利技术的方法提供了定量测定同时从有生命力的细胞个体分泌多重(例如，2、4、5、6、8、10、20)分泌产物的频率和分泌速率分布的方法，所述分泌产物例如，细胞因子。这些方法为一种实验体系中的许多问题提供了答案，包括“谁”(被试验细胞的表型或者谱系)、“什么”(分泌产物的一致性，例如，细胞因子、抗体、趋化因子或者生长因子)、“每隔多久有多少次”(在细胞群中反应因子的频率)和 “多少”(分泌的数量，例如，各种分泌产物的量的水平)。这些方法能够有效绘制任何分泌细胞的曲线，例如，免疫细胞，例如，T细胞或者B细胞，同时也能有效用于其他分泌细胞，例如，分泌激素或者酶的细胞。单个活体细胞的分泌曲线与其表型或者谱系相匹配(例如，由图像或者检查确定)，从而产生该细胞的分泌曲线。这种分泌曲线为诊断疾病或者监测对治疗介入的反应提供有价值的情报。例如本专利技术提供了一种诊断主体免疫性疾病的方法，所述免疫性疾病例如，传染病、自身免疫疾病或者过敏。在一些实施方案中，经过试验绘制单个细胞(或者一些细胞) 在个体内的免疫反应曲线，例如，过敏性反应。使用本专利技术方法产生的整体定量(多维)数据组来区分来自不同供体对不同刺激的细胞反应。这里描述的方法还可以有效用于疫苗、 治疗性生物药物、正处于发作期的传染病、自身免疫疾病等等的临床检测。在一个方面，本专利技术的特点在于一种测定主体免疫曲线的方法，例如，分泌细胞因子曲线。本方法包括提供来自主体的细胞(例如，活细胞)悬浮液，将其储存在可模压的平 板上，该平板在每一微孔列中包含至少一个微孔(每个微孔小于100x100x100 μ m3，例如， 是50x50x50 μ m3)，其中在微孔列中至少一个微孔具有单个细胞亚纳米升体积。在一个方面，所述细胞是全血细胞。在另一个方面，所述细胞是外周血单核细胞(PBMC)。将此微孔列于底物相接触，其中，所述底物预先使用至少一种检测试剂(例如，细胞因子检定剂)处理过，并且，其中，所述检测试剂与该细胞的一种分泌产物(例如，细胞因子)相结合。在一个方面，本专利技术使用至少两种检测试剂，至少三种检测试剂、或者至少四种检测试剂。测量底物上的检测试剂的水平，其中，所述水平相当于该细胞分泌产物的量，因此，检测免疫曲线。 任选的，所述检测试剂检测分泌产物的T细胞组。在另一个方面，所述检测试剂检测分泌产物的T-辅助因子2 (Th2)组。在一个方面，对于每种分泌产物确定分泌速率。在另一个方面，确定细胞的表型。 任选的，分泌产物与在此细胞上用于区分谱系的表面表达标记物相匹配。利用下列步骤进行确定个体活细胞曲线的方法提供来自主体的细胞悬浮液，将其储存在可模压的平板上，该平板在每一微孔列中包含至少一个微孔，其中在微孔列中至少一个微孔具有单个细胞亚纳米升体积；将此微孔列于底物相接触，其中，所述底物预先使用至少一种检测试剂处理过，并且，其中，所述检测试剂与该细胞的一种分泌产物相结合， 从而产生印模微阵列，对此印模微阵列成像，产生数据集；过滤数据集从而识别列中由单个细胞组成的位点；将此位点与单个细胞位点检测出的分泌产物水平相匹配，从而确定单个活细胞的免疫曲线。任选的，所述方法包括识别单个细胞的表型或者谱系，然后将此表型或者谱系与指定位点的分泌产物的水平相匹配。在一些实施方案中，所述曲线是一般的T细胞曲线、Thl曲线、Th2曲线、Th9曲线、 Thl7曲线、或其他的分泌细胞曲线，例如，所述底物包括适当的抗体对或者抗体系列，从而检测所关心的细胞因子。检测细胞因子的不同的示例性抗体组表现出非对称的Th反应和特异性Th2和ThI反应。例如，一般T细胞组检测下列细胞因子IL-4/IL-10/IL-17/IFN γ。 待检测细胞分泌产物中一种或者一种以上细胞因子的增加简单的勾勒出它的曲线。Th2组包括针对IL-4/IL-5/IL-9的检测试剂，检测细胞毒淋巴细胞(CTL)或ThI曲线的小组包括用于检测IFN γ/MIP-I β/TNF α/穿孔蛋白/IL-2的检测试剂，其中MIP和/或穿孔蛋白表明CTL表型的倾斜性，IL-2表明ThI表型的倾斜性。包括用于检测IFNy/IL-IO/IL-17/ IL-22的检测试剂的组可有效用于评价粘膜样品，例如，用于确定来自胃肠道的细胞的免疫曲线(也是一种评价疾病/紊乱或易患病的体质的方式)。检测抗体同型体可以有效用于评价过敏症或者过敏症潜伏期的个体。例如，研究检测试剂组，从而检测下列抗体的组(IgGl/ IgA/IgE/IgG4 and IgGl/IgA/IgG3/IgM)。检测到Ig同型抗体的增加说明对刺激性过敏源的过敏反应。代表性的Th组包括能够检测白细胞介素-17 (IL-17)、IL-IO, IL_4，干扰素 1 (IFN-Y)，IL-Ib, IL-2, IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-21，IL-22，IL-23，巨噬细胞炎症性蛋白(MlP)Ib，MlPIa，和/或干扰素诱导蛋白(IP)-IO的试剂。代表性的Th2组检测 IL-4，IL-5，IL-13和/或IL-9。在其他方面，对细胞表面表达标记物(例如，CD3，CD4，CD8， CD14, CD19, CD20, CD25, CD27, CD38, CD138, CD95, CD154, CD127)成像。这些标记物与各自细胞的细胞因子曲线相匹配，从而将这里描述的方法与其他之前描述的捕获方法区别开来。 本方法可以选择性的或者额外使用一种检测试剂来检测抗体，例如，IgE，IgGi, IgG4, IgGA, IgG2, IgG3, IgM, IgAl，和/或IgA2。优选的细胞因子检测试剂是一种抗体，例如，是细胞因子的一种多克隆抗体或者单克隆抗体。作为选择，所述细胞因子检测试剂是一种适体。通常，可以使用任何含有能够产生细胞因子的细胞的生物组织。在一些实施方案中，使用外周血单核细胞(PBMC)。如果需要的话，在将细胞沉积在可模塑平板上之前，对细胞进行刺激。例如，使用未知的或者已知的过敏原刺激细胞。作为选择，可以使用多肽、蛋白质或者来自传染本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种测定主体免疫曲线的方法，本方法包括：提供来自主体的细胞悬浮液，将其沉积在可模压的平板上，该可模压的平板在每一微孔列中包含至少一个微孔，其中在微孔列中至少一个微孔具有亚纳米升体积的单个细胞；将此微孔列与底物相接触，其中，所述底物预先使用至少一种检测试剂处理过，并且，其中，所述检测试剂与该细胞的一种分泌产物相结合；从而测定所述检测试剂在所述底物上的水平，所述水平相当于一定量的所述单一细胞分泌的产物；从而确定免疫曲线。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·C·洛夫，
申请(专利权)人：麻省理工学院，
类型：发明
国别省市：US