一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含Ｐ－Ｓ－Ｒ键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中Ｒ符合化学式（Ｉ），其中Ａ是成对取代的亚烷基基团，优选ＣＨ２，Ｘ和Ｙ独立地选自Ｓ和Ｏ，并且Ｒ０是选自下组，该组由以下各项组成：任选地取代的、碳键合的有机残基，例如特别是任选地取代的烷基或芳基、ＳＲｘ、ＯＲｘ和ＮＲｘＲｙ，其中Ｒｘ和／或Ｒｙ是选自Ｈ以及有机残基并且至少Ｒｘ是一个非Ｈ的取代基。本发明专利技术的另一个目的是可用于寡核苷酸制造的硫化剂及其制造。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及硫代磷酸酯寡核苷酸、其使用新硫化剂的制备、所述硫化剂及其制备。
技术介绍
寡核苷酸属于一类生物药剂，具有非常大的治疗不同疾病的潜力，这些疾病列举几个包括癌症、病毒感染、以及炎性疾病。推动寡核苷酸作为疗法的一个重要途径涉及对该寡聚物主链的修饰以提供除其他之外的代谢抗性、化学稳定性并且以改进至作用部位的体内运输。修饰的主链化学物的例子包括肽核酸类(PNA)(参见Nielsen，Methods Mol. Biol.，208 :3- ，2002)，锁核酸类(LNA)(参见 Petersen & Wengel，Trends Biotechnol.， 21(2) :74-81，2003)，硫代磷酸酯类(参见Eckstein，Antisense Nucleic Acid Drug Dev., 10(2) :117-21,2000),甲基膦酸酯类(参见 Thiviyanathan 等人，Biochemistry,41 (3) 827-38,2002)，氨基磷酸酯类(参见 Gryaznov，Biochem. Biophys. Acta, 1489 (1) 131-40， 1999 ;Pruzan 等人，Nucleic Acids Res. ,30(2) :559_68，2002)，硫代氨基磷酸酯类(参见 Gryaznov 等人，Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids,20(4-7) :401-10,2001 ； Herbert等人，Oncogene, 21 (4) =638-42, 2002) 0硫代磷酸酯的形成属于最有用的修饰，因为用P = S部分取代P = O使得寡核苷酸耐受核酸裂解降解而同时在大多数情况下保持了天然寡聚物的生物特性。硫代磷酸酯可以通过氧化硫化作用而形成(Oligonucleotide synthesis, methods and applications,P. Herdewij η Methods in Molecular Biology,volume 288, Chapter 4,51-63).主要存在两种制造硫代磷酸酯的方法，取决于对于这个反应所使用的磷酯(phosphorous esters)的性质以及所预期的产物。其中之一涉及将未取代的硫原子引入到磷中，例如通过元素硫、二苯酰基四硫化物、3-Η-1，2-苯并二硫-3-酮-1，1- 二氧化物(还称为 Beaucage 试剂，(Iyer 等人，J. Org. Chem. 55，4693-4699 (1990))，二硫化四乙基秋兰姆(TETD)、二硫化二甲基秋兰姆(DTD)、苯乙炔二硫化物(PADS)以及双(0，0-二异丙氧基硫膦基)二硫化物(称为Stec’ s试剂)。这些反应主要用于通过亚磷酰胺法在固体载体上的寡核苷酸的自动合成中并且包括在寡聚物的延长反应过程中所形成的磷三酯的氧化硫化作用。制造寡聚硫代磷酸酯的第二种方法是与H-膦酸酯法一起使用的并且涉及H-膦酸酯二酯与硫转移试剂之间的反应，其中带有脂肪族或芳香族取代基的硫原子被转移到磷上。在硫上的辅助取代基在该合成操作中起到了保护基团的作用并且通常在寡核苷酸制备的最后阶段被切除。这种方法特别适合于在溶液中合成寡核苷酸。相比对于将未取代的硫原子引入到磷酯中可得的试剂的大量选择，允许H-膦酸酯与受保护的硫进行硫化作用的基团的范围是有限的(例如，Dreef等人，Synlett,481-483,1990, US 6，506，894)。在实施中，仅氰基乙基硫化物基团在寡核苷酸的溶液合成过程中被广泛地用在这种反应中，其中在每一步骤都进行色谱纯化。寡核苷酸溶液合成的一个关键问题涉及在每个合成步骤中获得高的底物转化率与优异特异性的必要性从而给出高纯度的、处于有助于简单纯化之形式的产品，特别是避免了色谱法。鉴于缺少用于允许经济的溶液相合成的方法，这种溶液相技术目前似乎并未被用于商业规模的寡核苷酸合成。现在本专利技术披露了新的硫化剂，用于制造它们的方法以及它们在硫代磷酸酯寡核苷酸的经济并且合适的合成以及纯化中(特别是在溶液中)的用途。
技术实现思路
本专利技术具体地涉及在所附的权利要求中所描述的专利技术。本专利技术还涉及在本专利技术的说明书、特别是在实施例中实质性描述的方法以及试剂。本专利技术具有许多超过P-S连键(linkage)形成的现有方法的优点，特别是在所进行的寡核苷酸的合成中，优选地通过H-膦酸酯法。例如，使用这种新试剂转移到例如寡核苷酸上的残基R可以有助于寡核苷酸的结晶或沉淀，从而允许使用最小量的或不使用色谱法而简单地纯化这些产品。已经发现使用这种方法制造的、具有从两个到至少十六个核苷酸单元的寡核苷酸直到对所要求的寡核苷酸进行最终脱保护之后才有必要通过色谱法进行纯化。中间体寡聚物可以足够纯地获得以用于任选地在5’ -和3’ -位置上的脱保护作用以及(若希望的话)这些粗制脱保护材料与更高级的寡核苷酸的连接。在另一个优点中，所披露的方法提供了使用多种硫化剂的途径，这些硫化剂在使简单的、无色谱法的纯化的效率最大化的方面可以被用来修饰所形成的寡核苷酸的特性。根据本专利技术方法的又一个优点在于例如硫保护的酰氧基亚甲基RC(O)-OCH2的简单切除可以在温和的条件下，例如使用伯胺或仲胺或受阻胺(例如正丙胺或叔丁胺)容易地完成。当使用胺任选地处理时， 发生了自发切除，包括硫-亚甲基键，由此允许P = S键的干净的形成。这些切除产物可以很容易地通过溶剂或水的洗涤而去除。例如酰氧基亚甲基基团的稳定性特征(例如在碱性的非亲核条件下)允许沿着合成路径的选择性脱保护反应并且由此允许合成方案的更大的灵活性，例如通过阻止核碱基保护基团的切除。开发一种用于合成寡核苷酸(尤其是在溶液中)的经济方法的重要因素是在寡核苷酸链延长过程的每个步骤的转化产物的纯度。尽管根据本专利技术的方法确保了高的产物产率以及纯度，每个延长周期总体上包括三个步骤并且有利的是除去即使少量的杂质，否则这些杂质将会沿着路径而累积。由于有众多的步骤，因此在每个步骤中使用色谱法在实际的大规模寡核苷酸合成中可能不是经济上可行的。因此，我们还披露了用于纯化链延长过程中所形成的寡核苷酸的无色谱法的方法。本专利技术的一个第一具体目的是提供寡核苷酸，这些寡核苷酸包括至少一个包含 P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)权利要求1.一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含P-S-R键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中R符合以下化学式(I)2.根据权利要求1所述的寡核苷酸，其中R选自亚甲基酰氧基基团、亚甲基碳酸酯基团以及亚甲基氨基甲酸酯基团。3.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合化学式-CH2-O-C(O)-Rtl, 其中Rtl是C1-C20的、饱和的、不饱和的、杂环的或芳香族的烃残基。4.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合具有化学式-CH2-O-C(O)-NRxRy的亚甲基氨基甲酸酯基团，其中民和Ry独立地选自烷基或(杂)芳基，优选地Rx和Ry是烷基或者民和Ry —起形成3至8元环，任选地包含选自0、N和S的附加的环杂原子。5.根据权利要求1或2中任一项所述的寡核苷酸，其中R符合本文档来自技高网...
【技术保护点】
机残基，例如特别是任选取代的烷基或芳基、ＳＲｘ、ＯＲｘ和ＮＲｘＲｙ，其中Ｒｘ和／或Ｒｙ是选自Ｈ以及有机残基并且至少Ｒｘ是非Ｈ取代基。１．一种寡核苷酸，该寡核苷酸包括至少一个包含Ｐ－Ｓ－Ｒ键的核苷酸间连键以及至少两个核苷，其中Ｒ符合以下化学式（Ｉ）其中Ａ是成对取代的亚烷基基团，优选ＣＨ２，Ｘ和Ｙ独立地选自Ｓ和Ｏ，并且Ｒ０是选自下组，该组由以下各项组成：任选取代的碳键合的有
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：维斯瓦夫·亚当·马祖尔，
申请(专利权)人：集润德斯股份公司，
类型：发明
国别省市：US
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