溶瘤性腺病毒载体及与其相关的方法和用途技术

本发明专利技术涉及生命科学和医药领域。特别地，本发明专利技术涉及癌症疗法。更特别地，本发明专利技术涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本发明专利技术还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本发明专利技术涉及在细胞中产生ＧＭ－ＣＳＦ和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本发明专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生ＧＭ－ＣＳＦ和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】溶瘤性腺病毒载体及与其相关的方法和用途专利
本专利技术涉及生命科学和医药领域。特别地，本专利技术涉及癌症疗法。更特别地，本专利技术涉及溶瘤性腺病毒载体以及包含所述载体的细胞和药物组合物。本专利技术还涉及所述载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途，以及治疗受试者中的癌症的方法。此外，本专利技术涉及在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的方法，以及涉及本专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中产生GM-CSF和在受试者中增加肿瘤特异性免疫应答的用途。
技术介绍
可用外科手术、激素疗法、化学疗法和/或放射疗法治疗癌症，但是在许多情况下，通常表征为晚期的癌症不能用目前的疗法治愈。因此，需要新的靶向癌细胞的方法，例如基因疗法。在过去20年中，基因转移技术得到了密集的检测。癌症基因疗法的目的是将治疗性的基因引入肿瘤细胞中。这些被引入靶细胞中的治疗性基因可以例如，纠正被突变的基因、抑制活跃的致癌基因或对细胞产生其它的性能。适合的外源治疗性基因包括但不限于免疫治疗性基因、抗血管生成性基因、化学保护性基因和“自杀”基因，并且可利用经修饰的病毒载体或非病毒方法(包括电穿孔、基因枪和脂质或聚合物包被)将它们引入细胞。对最优的病毒载体的要求包括找到特定靶细胞并在靶细胞中表达病毒基因组的有效能力。此外，最优的载体必须在靶组织或细胞中保持是有活性的。在过去的几十年中已经开发了病毒载体的所有这些特性并且在生物医学中广泛地研究了例如逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒载体。为了进一步提高肿瘤穿透性和抗肿瘤效果的局部放大，构建了选择性的溶瘤剂，例如条件性复制的腺病毒。溶瘤性腺病毒是用于治疗癌症的有希望的工具。肿瘤细胞是由于溶瘤性腺病毒在肿瘤细胞中的复制而被所述病毒杀死的，复制的最后时期导致数千的病毒粒子被释放到周围的肿瘤组织中用于有效的肿瘤穿透和脉管再次感染。肿瘤细胞允许病毒的复制而正常的细胞由于病毒基因组中经改造的变化而幸免，所述变化防止在非肿瘤细胞中复制。除了复制介导的细胞杀伤，还可用不同的治疗性转基因装备溶瘤性腺病毒。这一方法结合了常规基因递送的优点与能够复制的试剂的效力。装备病毒的一个目标是诱导针对允许病毒复制的细胞的免疫反应。单独的病毒复制虽然是免疫原性的，但是通常不足以诱导有效的抗肿瘤免疫性。为了强化对治疗性免疫性的诱导，可用激发性蛋白(例如细胞因子)装备病毒，用于促进将肿瘤抗原引入抗原呈递细胞(例如树突细胞)，以及用于它们的激发和/或成熟。将免疫治疗性基因引入肿瘤细胞中以及蛋白质的翻译，导致免疫应答的活化和有效地破坏肿瘤细胞。在这方面最相关的免疫细胞是天然杀伤细胞(NK)和细胞毒性CD8+T细胞。腺病毒是中等大小(90-100nm)的无包膜二十面体病毒，其在蛋白衣壳中具有约3万6千个碱基对的双链线性DNA。病毒衣壳具有纤毛结构，其参与病毒对靶细胞的附着。首先，纤毛蛋白的节结构域(knobdomain)结合靶细胞的受体(例如，CD46或柯萨基病毒腺病毒受体(CAR))；第二，病毒与整联蛋白分子相互作用；和第三，病毒被内吞到靶细胞中。接下来，病毒基因组从胞内体被转运到核中并且还将靶细胞的复制装置用于病毒的目的RussellW.C.2000，JGeneralVirol81，2573-2604)。腺病毒基因组具有早期(E1-E4)、中期(IX和IVa2)和晚期基因(L1-L5)，它们以顺序次序被转录。早期基因的产物影响宿主细胞的防御机制、细胞周期和细胞代谢。中期和晚期基因编码用于生产新的病毒粒子的结构性病毒蛋白(Wu和Nemerow，2004，TrendsMicrobiol12：162-168；RussellW.C.2000，JGeneralVirol81，2573-2604；VolpersC.和KochanekS.2004，JGeneMed6suppl1，S164-71；KootstraN.A.和VermaI.M.2003，AnnuRevPharmacolToxicol43，413-439)。在人中已发现了腺病毒的超过50种不同的血清型。血清型被分为6个亚组A-F并且不同的血清型已知与不同的病况(即呼吸系统疾病、结膜炎和肠胃炎)相关。已知腺病毒血清型5(Ad5)引起呼吸系统疾病并且其是基因疗法领域中所研究的最常见的血清型。在最初的Ad5载体中，缺失了E1和/或E3区而使得能够将外源DNA插入载体中(Danthinne和Imperiale2000)。此外，缺失其它区域以及另外的突变为病毒载体提供了另外的特性。的确，已经建议了对腺病毒的各种修饰用于实现有效的抗肿瘤效果。例如，专利EP1377671B1(CeLLGenesys，Inc.)和专利申请US2003/0104625A1(ChengC.等人)描述了编码免疫治疗性蛋白粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的溶瘤性腺病毒载体。此外，公开EP1767642A1(ChengduKanghongBiotechnologiesCo.，Ltd.)指出溶瘤性腺病毒载体在人免疫应答方面具有改善的效果。此外，保证了基因疗法的更有效和准确的基因递送以及增加的特异性和足够的肿瘤杀伤能力。治疗性载体的安全性记录必须也是出色的。本专利技术通过以新的和有创造性的方式利用腺病毒的溶瘤和免疫治疗特性，提供了具有前述特性的癌症治疗工具。专利技术简述本专利技术的目的是提供用于实现腺病毒的上述特性的新的方法和手段，并从而解决常规癌症疗法的问题。更特别地，本专利技术提供了用于基因疗法的新方法和手段。本申请描述了重组病毒载体的构建，与所述载体相关的方法和它们在肿瘤细胞系、动物模型及癌症患者中的用途。本专利技术涉及包含腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架、在腺病毒E1的Rb结合恒定区2中的24bp的缺失(D24)、和替代腺病毒E3区中缺失的gp19k/6.7K的编码粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸序列的溶瘤性腺病毒载体。本专利技术还涉及包含本专利技术的腺病毒载体的细胞。本专利技术还涉及包含本专利技术的腺病毒载体的药物组合物。本专利技术还涉及本专利技术的腺病毒载体在制备用于治疗受试者中的癌症的药物中的用途。本专利技术还涉及治疗受试者中的癌症的方法，其中所述方法包括向受试者施用本专利技术的载体或药物组合物。此外，本专利技术还涉及在细胞中生产GM-CSF的方法，其中所述方法包括：a)将包含本专利技术的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至细胞，和b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF。此外，本专利技术还涉及增加受试者中肿瘤特异性免疫应答的方法，其中所述方法包括：a)将包含本专利技术的溶瘤性腺病毒载体的媒介运送至靶细胞或组织，b)在所述细胞中表达所述载体的GM-CSF，和c)在所述靶细胞或组织中增加细胞毒性T细胞和/或天然杀伤细胞的量。此外，本专利技术还涉及本专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中生产GM-CSF的用途。另外，本专利技术涉及本专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于在细胞中生产GM-CSF。此外，本专利技术还涉及本专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于增加受试者中的肿瘤特异性免疫应答的用途。此外，本专利技术涉及本专利技术的溶瘤性腺病毒载体用于增加受试者中的肿瘤特异性免疫应答。本专利技术提供了用于治疗癌症的工具，所述癌症是目前的方法难以治疗的。此外，与许多其它的治疗相比，在适于治疗的肿瘤类型方面的限制很少。实本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．溶瘤性腺病毒载体，其包含腺病毒血清型５（Ａｄ５）核酸骨架，Ｅ１的Ｒｂ结合恒定区２中的２４ｂｐ的缺失（Ｄ２４）和替代Ｅ　３区中缺失的ｇｐ１９ｋ／６．７Ｋ的编码粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）的核酸序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】FI200806712008年12月22日1.溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，其包含：腺病毒血清型5(Ad5)核酸骨架，天然E1A启动子，E1的Rb结合恒定区2中的24bp的缺失(D24)，替代E3区中缺失的gp19k/6.7K的包含SEQIDNO7的核苷酸28380～28814、且编码人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的核酸序列，所述核酸序列在病毒E3启动子的控制之下，和衣壳修饰，所述衣壳修饰是Ad5/3嵌合体，将整联蛋白结合(RGD)区和/或结合硫酸肝素的聚赖氨酸修饰插入纤毛中。2.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征还在于，其包含选自下列的一个或多个区域：E2、E4和晚期区域。3.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于包括下列区域：左ITR、部分E1、pIX、pIVa2、E2、VA1、VA2、L1、L2、L3、L4、部分E3、L5、E4和右ITR。4.根据权利要求3的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述区域以顺次顺序在5’至3’的方向上。5.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，野生型区域位于E1区的上游。6.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，E1区包含病毒的包装信号。7.根据权利要求2或3的溶瘤性腺病毒载体，其中E4区域是野生型的。8.根据权利要求1的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述衣壳修饰是RGD-4C修饰。9.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，包含至少一个表达盒。10.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，仅包含一个表达盒。11.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，所述载体能够在Rb通路中有缺陷的细胞中选择性地复制。12.根据权利要求1～4中任一项的溶瘤性腺病毒载体，其特征在于，其作为原位癌症疫苗起作用。13.细胞，其特征在于，包含根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体。14.药物组合物，其特征在于，包含根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体。15.根据权利要求14的药物组合物，其特征在于，其作为原位癌症疫苗起作用。16.根据权利要求1～12中任一项的腺病毒载体在制备药物中的用途，其中所述药物用于治疗人受试者中的癌症或良性肿瘤。17.根据权利要求16的用途，其特征在于，所述癌症选自：肺癌、脑癌、肝癌、骨癌、胰腺癌、乳腺癌、头癌、颈癌、眼癌、前列腺癌、睾丸癌、皮肤癌、间皮瘤、软组织肉瘤、食管癌、胃癌及心脏癌，且所述良性肿瘤选...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·海明基，
申请(专利权)人：昂克斯治疗有限公司，
类型：发明
国别省市：FI