在抗体纯化过程中的病毒灭活制造技术

本文描述的是用于从样品基质分离且纯化抗体的方法。本公开内容的一个方面涉及在抗体纯化的各个步骤中生成的样品的病毒减少／灭活。在特定方面，本文方法采用酸化步骤，随后为一个或多个层析步骤。层析步骤可以包括一个或多个下述层析程序：离子交换层析、亲和层析和疏水作用层析。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】在抗体纯化过程中的病毒灭活与相关申请的交叉参考本申请要求于2008年10月20日提交的美国临时申请系列号61/196，754的利益，其在此整体引入作为参考。
技术介绍
用于通过发酵培养生产的药物级别单克隆抗体的纯化方法一般涉及4个基本步骤。这些步骤包括(1)收获/澄清-宿主细胞与发酵培养物分离；(2)捕获-抗体与澄清的收获物中的大多数组分分离；(3)精细纯化-去除残留的宿主细胞污染物和聚集体；和(4) 配制-将抗体置于合适载体内用于最大限度的稳定性和保存期限。然而，通常这些步骤不一定解决可能的病毒污染。目前需要生产且纯化适合于临床用途的目的抗体的方法，其包括污染性有害病毒的减少和/或灭活。本专利技术解决了这个需要。专利技术_既述本专利技术涉及用于从样品基质分离且纯化抗体的方法。本专利技术的一个方面涉及在抗体纯化的各个步骤中生成的样品的病毒灭活。在特定方面，本文方法采用酸灭活步骤，随后为一个或多个层析步骤。层析步骤可以包括一个或多个下述层析程序离子交换层析、亲和层析和疏水作用层析。进一步地，本专利技术涉及包括通过本文描述的方法纯化的一种或多种抗体的药物组合物。本专利技术的一个实施方案涉及从样品基质纯化抗体或其抗原结合部分，从而使得所得到的抗体组合物基本上不含宿主细胞蛋白质(“HCPs”)的方法。在一个方面，样品基质(或简单地“样品”)包括细胞系收获物，其中所述细胞系用于产生本专利技术的特定抗体。在具体方面，样品基质由用于产生抗IL-12抗体的细胞系制备；在另一个方面，样品基质由用于产生抗TNFa抗体的细胞系制备；并且在另一个方面，样品基质由用于产生抗IL-18抗体的细胞系制备。本专利技术的一种方法涉及对包括推定的目的抗体或其抗原结合部分的样品基质实施PH调整。在一个方面，将pH调整至酸性pH。合适pH的例子是约3 -约5，优选约3.5。 这个初步回收部分为减少或灭活PH敏感性病毒而执行。除减少和/或灭活病毒外，酸性条件还促进细胞和细胞碎片的去除，从而形成初步回收样品。在合适的时间段后，PH可以朝向更中性或碱性的PH调整，并且在特定实施方案中，将对样品实施一个或多个层析步骤， 包括但不限于亲和层析、离子交换层析和疏水作用层析。在一个实施方案中，亲和层析步骤包括使初步回收样品经历包括合适亲和层析支持体的柱的处理。此种层析支持体的非限制性例子包括但不限于A蛋白树脂、G蛋白树脂、 包括针对其产生目的抗体的抗原的亲和支持体、和包含Fc结合蛋白的亲和支持体。A蛋白树脂用于抗体(IgG)的亲和纯化和分离。在一个方面，在样品装载前，A蛋白柱用合适缓冲液进行平衡。合适缓冲液的例子是^^8/妝(1缓冲液，？!1约7.2。在这个平衡后，可以将样品装载到柱上。在柱装载后，柱可以使用例如平衡缓冲液洗涤一次或多次。可以在洗脱柱前使用其他洗涤，包括采用不同缓冲液的洗涤。A蛋白柱随后可以使用合适的洗脱缓冲液进行洗脱。合适洗脱缓冲液的例子是乙酸/NaCl缓冲液，？!1约3.5。洗脱物可以使用本领域技术人员众所周知的技术进行监控。例如，可以注意在OD28tl的吸光度。随后可以制备一种或多种目的洗脱的级分用于进一步加工。在特定实施方案中，对样品实施一个或多个另外的层析程序。在一个方面，对初步回收样品实施离子交换层析。在这个实施方案中，离子交换步骤可以是阳离子或阴离子交换层析或两者的组合。这个步骤可以包括多个离子交换步骤，例如阳离子交换步骤随后为阴离子交换步骤，或反之亦然。在一个方面，离子交换步骤涉及两步骤离子交换过程。在特定方面，第一个阳离子交换步骤随后为第二个阴离子交换步骤。合适的阳离子交换柱是其固定相包括阴离子基团的柱。此种柱的例子是Fractogel S03_柱。这个离子交换捕获层析步骤促进从初步回收样品分离目的抗体。合适的阴离子交换柱是其固定相包括阳离子基团的柱。此种柱的例子是Q kpharose 柱。一个或多个离子交换步骤通过减少杂质进一步分离抗体，所述杂质例如宿主细胞蛋白质和DNA以及在可应用时的亲和基质蛋白质。这个阴离子交换程序是层析的流通(flow-through)模式(与阳离子交换程序形成对比)，其中抗体不与阴离子交换树脂(或固相)相互作用或结合。然而，许多杂质的确与阴离子交换树脂相互作用且结合。在另一个实施方案中，对离子交换样品实施进一步层析。在一个方面，这个步骤涉及疏水作用层析(“HIC”)的使用。合适的柱是其固定相包括疏水基团的那种。此种柱的例子是苯基％ 11虹0^ 柱。可能的是抗体在分离/纯化过程期间已形成聚集体。这个疏水层析步骤促进这些聚集的消除。它还帮助去除杂质。该程序使用高盐缓冲液，其促进抗体 (或其聚集)与疏水柱的相互作用。柱使用较低浓度的盐进行洗脱。在一个实施方案中，在初步回收后执行第一个和第二个离子交换步骤。在这个实施方案中，对离子交换样品实施中间过滤步骤。在一个方面，这个过滤步骤包括捕获超滤/ 渗滤(“UF/DF”)。这个过滤步骤促进例如抗体及其抗原结合部分的浓缩。在另一个实施方案中，HIC洗脱物使用病毒去除滤器例如Ultipor DV50 滤器进行过滤。这个程序使病毒颗粒与苯基洗脱物分离，以使病毒(如果存在的话)量减少至安全水平。本领域技术人员众所周知的滤器可以在这个实施方案中使用。在所得到的样品产物中单克隆抗体的纯度可以使用本领域技术人员众所周知的方法进行分析，例如蛋白质印迹分析。在另外一个实施方案中，本专利技术涉及包括分离的单克隆抗体或其抗原结合部分和可接受载体的一种或多种药物组合物。在另一个方面，组合物进一步包括一种或多种药物试齐LU附图简述附图说明图1公开了抗IL-12抗体(ABT-847)的非限制性例子的重和轻链可变区序列。图2公开了抗IL-18抗体(ABT-325)的非限制性例子的重和轻链序列。图3公开了抗TNFa抗体(阿达木单抗(Adalimumab))的非限制性例子的重和轻链序列。图4描述了本专利技术的纯化方案的非限制性流程图。图5是指出待纯化的抗体分子在澄清的培养基的PH降低后保留在溶液中的聚丙烯酰胺电泳凝胶照片。专利技术详述本专利技术涉及用于从样品基质分离且纯化抗体的方法。本专利技术的一个方面涉及在抗体纯化的各个步骤中生成的样品的病毒灭活。在具体方面，本文的方法采用酸灭活步骤，随后为一个或多个层析步骤。层析步骤可以包括一个或多个下述层析程序离子交换层析、亲和层析和疏水作用层析。进一步地，本专利技术涉及包括通过本文描述的方法纯化的一种或多种抗体的药物组合物。为了清楚起见且非限制性地，这个详述分成下述亚部分1.定义；2.抗体生成；3.抗体生产；4.抗体纯化；5.测定样品纯度的方法；6.进一步修饰；7.药物组合物；和8.抗体用途。1.定义为了本专利技术可以更容易理解，首先定义了特定术语。术语“抗体”包括免疫球蛋白分子，其包含通过二硫键互连的4条多肽链一一 2条重(H)链和2条轻(L)链。每条重链包括重链可变区(本文缩写为HCVR或VH)和重链恒定区(CH)。重链恒定区包括3个结构域一一 CH1、CH2和CH3。每条轻链包括轻链可变区(本文缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括一个结构域一一 CL。VH和VL区可以进一步再分成称为互补性决定区(CDRs)的高变区，由称为构架区(FR)的更保守区域点缀。 每个VH和VL由3本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于从包括抗体、宿主细胞蛋白质（ＨＣＰ）和病毒颗粒的样品混合物中产生宿主细胞蛋白质减少的抗体制剂的方法，其中与所述样品混合物相比较，所述制剂包括减少数目的病毒颗粒或减少的病毒活性，所述方法包括：（ａ）对所述样品基质实施ｐＨ的减少，从而形成初步回收样品，其中所述ｐＨ的减少是至ｐＨ约３　–　约５；（ｂ）将所述初步回收样品调整至约４．５　–　约６．５的ｐＨ，随后将所述初步回收样品应用于离子交换树脂，且收集离子交换样品；（ｃ）将所述离子交换样品应用于疏水作用层析（ＨＩＣ）树脂，且收集ＨＩＣ样品，其中所述ＨＩＣ样品包括所述ＨＣＰ减少的抗体制剂。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：RK希克曼，
申请(专利权)人：雅培制药有限公司，
类型：发明
国别省市：US