单克隆抗体的拮抗活性的调节方法技术

本发明专利技术公开内容涉及抗体工程化领域，并且更特别地，涉及筛选抗体和／或调节抗体激动／拮抗活性的方法。更特别地，本发明专利技术公开内容涉及提高针对特定目标分子的单克隆抗体，或其二价功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗体能够抑制所述目标分子的一种或多种生物活性，其中所述方法包括铰链区重新构建的阶段，该阶段由通过至少一个氨基酸的删除、添加或置换来修饰所述铰链区的氨基酸序列组成。本发明专利技术公开内容还涉及用于这种调节方法的多肽和所获得的抗体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及抗体工程化领域，并且更特别地，涉及筛选抗体和/或调节抗体的激动/拮抗活性的方法。更特别地，本专利技术涉及通过遗传工程化调节单克隆抗体或其二价功能化片段或衍生物的拮抗活性的方法。本专利技术还涉及用于这种调节方法的多肽和所获得的抗体。
技术介绍
术语“一种抗体”、“多种抗体”或“免疫球蛋白”以最宽意思互换使用，并且包括单克隆抗体(例如，全长或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体或多特异性抗体(例如，双特异性抗体，只要它们呈现出所需的生物活性)。更特别地，这样的分子由糖蛋白组成，所述糖蛋白包含通过二硫键链间连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链。每个重链由重链可变区(或结构域)(在此缩写为HCVR 或VH)和重链恒定区组成。重链恒定区由三个结构域CHI、CH2和CH3组成。每个轻链由轻链可变区(在此缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可以进一步细分成超可变性区，称为互补性决定区(CDR)，穿插有具更保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，以以下顺序从氨基端排列至羧基端FR1、CDRl、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和典型补体系统的第一成分(Clq)。免疫球蛋白的重链可以分成三个功能区Fd区、铰链区、Fc区(可结晶片段)，其通过柔性铰链区来连接。Fd区包含VH和CHl结构域，并且结合轻链，形成Fab-抗原结合片段。Fc片段负责免疫球蛋白效应物功能，其包括，例如，补体固定和结合至效应物细胞的同源Fc受体。在IgG、IgA和IgD免疫球蛋白类别中发现的铰链区作为柔性间隔物，使Fab 部分在相对于Fc区的空间中自由移动。与恒定区相反，铰链结构域在结构上是多变的，在免疫球蛋白类别和亚类中的序列和长度都有变化。根据结晶研究，免疫球蛋白铰链区可以在结构和功能上进一步细分成三个区上铰链、核心和下铰链(Shin等，Immunological Reviews 130:87,1992)。上铰链包括从CHl 羧基端至限制运动的铰链中第一个残基的氨基酸，通常为两个重链之间形成链间二硫键的第一个半胱氨酸残基。上铰链区的长度与抗体的片段柔性相关。核心铰链区含有重链间二硫桥键。下铰链区连接CH2结构域的氨基端，并包括CH2结构域中的残基。人IgGl的核心铰链区含有序列Cys-Pro-Pro-Cys，其通过二硫键形成二聚化时，形成环八肽，认为这作为枢轴，由此给予柔性。由免疫球蛋白铰链区多肽序列的结构和柔性产生的构象变化可能影响抗体Fc部分的效应物功能。通常，对于鼠来源的单克隆抗体或其功能性片段的制备，可能参考特别在手册“抗体，，中描述的技术(Harlow 禾口 Lane，Antibodies :A Laboratory Manual (抗体实验室手册)，Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor NY,pp. 726,1988)或 Kohler和Milstein所述的从杂交瘤的制备技术(Nature, 256 =495-497,1975) 然后，例如，单克隆抗体可以在亲和性柱上纯化，在柱上之前已经固定了目标受体或其含有所述单克隆抗体特异性识别的表位的片段之一。更特别地，所述单克隆抗体可以通过蛋白A和/或G的色谱来纯化，接着进行或不进行针对消除残余蛋白污染物以及DNA和LPS的离子交换色谱，本质上接着进行或不进行kpharose凝胶上的排阻色谱，以消除由于二聚体或其他多聚体的存在引起的潜在聚集物。在甚至更优选的方式中，同时或连续使用这些技术的全部。
技术实现思路
根据本专利技术的抗体的功能性片段，特别用来表示抗体片段，如Fv、SCFv(SC表示单链)、Fab、F(ab，)2、Fab\ scFv-Fc片段或二抗，或其半衰期已经通过化学修饰提高的任何片段，化学修饰如添加聚(烷撑)甘醇，如聚(乙烯)甘醇(“PEG化”)(称为Fv-PEG、 scFv-PEG、Fab-PEG、F(ab，)2_PEG 或 Fab，-PEG 的 PEG 化片段)(“PEG” 表示聚(乙烯)甘醇)，或通过将具有原始抗体的至少一个特征性CDR的所述片段掺入脂质体中。优选，这些功能性片段将是？^80 1 313、？(313，)2、F(ab，)、scFv-Fc型或二抗的片段，其通常具有与产生其的抗体相同的结合特异性。根据本专利技术，本专利技术的抗体片段可以通过如酶消化的方法，如胃蛋白酶或木瓜蛋白酶，和/或通过化学还原的二硫桥键的分裂， 从如上所述的抗体获得。在另一种方式中，本专利技术中包含的抗体片段可以通过本领域技术人员同样公知的遗传重组技术来获得，或者通过肽合成获得，例如通过自动化肽合成仪，如 Applera等公司供应的那些。如在此所用的术语“拮抗剂”指的是能够抑制目标分子(如胞外或跨膜受体)的一种或多种生物活性的分子。拮抗剂可以通过干扰受体与配体的结合和反之，通过降低受体磷酸化和/或通过使已经由配体激活的细胞丧失能力或杀灭这些细胞来起作用。拮抗剂可以完全阻止受体-配体相互作用或可以本质上通过竞争、构象变化、脱落或下调降低这种相互作用。通过拮抗剂产生的所有这样的干扰点将认为是本专利技术目的的等价物。如在此所用的术语“激动剂”指的是能够激活目标分子的一种或多种生物活性的任何化合物，包括蛋白、多肽、肽、抗体、抗体片段、偶联物、大分子、小分子。在治疗抗体的研究中，常常期望具有可能作为拮抗剂的抗体。拮抗剂抗体的典型实例是赫塞汀、帕妥珠单抗、爱必妥、抗-VEGFR或抗-IGF-IR抗体。作为特定实例，可以提及由Genentech产生的抗-c-Met 5D5抗体， 其在各种模型中单独加入时，表现为有效的激动剂。为了解决这个技术问题，该抗体必须工程化成Fab片段或单价抗体(一臂5M)，以具有拮抗活性。因此，这样的抗体不能认为是抗体，而是片段，并且没有呈现出由于“全抗体”形式产生的所有优点(无效应物功能、降低的清除和半衰期)。本领域技术人员将认识到效应物功能包括，例如，Clq结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体-依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；嗜菌作用；和细胞表面受体 (例如，B细胞受体；BCR)的下调和通过结合清道夫受体结合配体(Fcfoi)延长半衰期，如， 例如，1988年4月14日授权的U. S.专利No. 5，739，277中所述的。本专利技术的一个创造性方面是解决这样的技术问题，即，提高抗体的拮抗活性，同时保持“全二价”形式。在此必须提及本专利技术可以用于调节人抗体的激动/拮抗活性，人抗体是通过如下方法获得的通过免疫“人小鼠”获得(遗传修饰的产生人免疫球蛋白的小鼠)或使用噬菌体展示技术从选定的ScFV、Fab或任何其他等价片段构建完整的抗体。在鼠抗体的嵌合和/或人源化的过程中可能会遇到另一个传统的技术问题。本领域技术人员公知，如果鼠抗体的嵌合和/或人源化过程在理论上是非常容易的，但不是这么容易控制这样的鼠抗体的嵌合和/或人源化，以至不失去全部或部分的初始特性。嵌合或人源化抗体可能失去一部本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种提高针对特定目标分子的单克隆抗体、或其二价功能片段或衍生物的拮抗活性的方法，所述抗体能够抑制所述目标分子的一种或多种生物活性，其中所述方法包括铰链区重新构建的阶段，该阶段由通过至少一个氨基酸的删除、添加或置换来修饰所述铰链区的氨基酸序列组成。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：L·格奇，
申请(专利权)人：皮埃尔法布雷医药公司，
类型：发明
国别省市：FR